蔬菜基因定位的方法

表型調(diào)查：

分別2014、2015和2017年種植親本、F1及DH群體，2次田間重復(fù)，每個重復(fù)種植3株；由于2014年環(huán)境影響表型數(shù)據(jù)缺失度較高，如果用這個數(shù)據(jù)可能影響QTL定位分析，因此，后續(xù)作者利用BLUE分析來解決這種由于多年表型數(shù)據(jù)偏差，使得3年數(shù)據(jù)均得到利用。因空心莖這個表型調(diào)查比較困難，所以只簡單的分為空心莖和非空心莖2種類型。

方法：SLAF測序，HighMap構(gòu)建遺傳圖譜，IciMapping進(jìn)行QTL定位，MapQTL進(jìn)行BLUE分析及QTL定位

1、SLAF遺傳圖譜

測序數(shù)據(jù)與 TO1000基因組進(jìn)行比對，比對率為75.99%，有24.01%是沒有比對上的，比對率較低主要是可能由于2種原因?qū)е隆蚪M差異和結(jié)構(gòu)變異。因?yàn)槲魈m花和甘藍(lán)型TO1000是2個品種，由此可見一個物種中一個品種的基因組并不能包含這個物種所有的信息。

開發(fā)了185,349個SLAF標(biāo)記，其中，20,250個SLAF標(biāo)記可以成功分型，最終上圖的標(biāo)記為4787個，分布于9個LG中，構(gòu)建一張平均圖距為0.22cM的遺傳圖譜（如下圖），標(biāo)記間最大gap超過10cM，這可能是由于小孢子培養(yǎng)構(gòu)建DH群體的過程中，可能某種基因型更容易形成胚胎和再生植株，從而產(chǎn)生偏分離或某段染色體區(qū)域中無個體發(fā)生重組。

圖2 西蘭花遺傳圖譜

2、QTL定位

利用3年表型數(shù)據(jù)定位到8個相關(guān)位點(diǎn)，其中QHS.C09-1的表型變異率為15.6%（叮咚——有主效位點(diǎn)了，盤它），其余位點(diǎn)均為小于10%。還有上面的小助手BLUE也幫助找到了一個位點(diǎn)QHS.C09-2，其表型變異率為14.1%。其中QHS.C09-1和QHS.C09-2存在部分重疊，因此認(rèn)為QHS.C09-2也是與空心莖相關(guān)的主效QTL。

圖3 QTL定位結(jié)果

圖4 BLUE分析結(jié)果

開發(fā)了406,563個SLAF標(biāo)簽，171,413個是為多態(tài)的，其中94,733個SLAF標(biāo)簽可成功分型，最終構(gòu)建了含有9,038 個標(biāo)記的遺傳圖譜，12個LGs，總圖距為1,586.78 cM，平均圖距為0.18 cM?；蚪M與遺傳圖譜共線性均≥0.9。

2、QTL定位

雙親、F1及F2:3家系，3年3個環(huán)境下的表型調(diào)查，發(fā)現(xiàn)雙親均為極端類型，而F1和F2:3家系均趨向于中親類型，認(rèn)為花期和單節(jié)花數(shù)為數(shù)量性狀。利用R/QTL定位到6個QTL，3個與花期相關(guān)，3個與單節(jié)花數(shù)相關(guān)。他們分別能夠解釋46.35-50.37%和99.13-99.76%的花期和單節(jié)花數(shù)的表型變異。利用QTL.gCIMapping.GUI定位到了2個與單節(jié)花數(shù)相關(guān)的新微效QTL。

3、候選基因預(yù)測

花期相關(guān)基因：針對主效QTL——Ft2.1進(jìn)行重點(diǎn)分析，它處于遺傳圖譜上的區(qū)間為0.763cM，對應(yīng)的Zunla-1基因組上物理區(qū)間為210Kb，包含25個基因，其中存在之前鑒定到的Capana02g000700基因，編碼花器官同源異型蛋白。進(jìn)化分析表明Capana02g000700的同源基因，金魚草LIP1和LIP2、擬南芥APETALA2和辣椒CaAP2，均在花器官發(fā)育階段存在重要作用。同時，比對雙親間序列差異，發(fā)現(xiàn)8個SNP標(biāo)記和1個6bp的InDel標(biāo)記，這導(dǎo)致親本CA1存在2個氨基酸的缺失和5個氨基酸的改變。繼DNA層面分析之后，RNA層面的分析qRT-PCR和RNA-seq表明，這個基因在雙親間存在差異表達(dá)，且在花器官中表達(dá)量最高，最終認(rèn)為Capana02g000700就是控制花期的候選基因。

單節(jié)花數(shù)相關(guān)基因：主效QTL——Mf2.1，它處于遺傳圖譜上的區(qū)間為0.382cM，對應(yīng)的Zunla-1基因組上物理區(qū)間為1400Kb，包含98個基因。單節(jié)花數(shù)是基于芽尖的分生組織變化產(chǎn)生的差異，已由報道表明營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L過程中，產(chǎn)生明顯表達(dá)差異的為轉(zhuǎn)錄因子（TF）。且Mf2.1定位區(qū)間內(nèi)也包含很多TFs。結(jié)合已報道的中間營養(yǎng)分生組織、過渡分生組織和成花分生組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在過渡分生組織中多數(shù)基因表達(dá)是上調(diào)，其中包含不同家族的TF，因此將這些上調(diào)的TF作為控制單節(jié)花數(shù)的候選基因。

圖6 主效QTLFt2.1的局部連鎖圖和基因表達(dá)分析

4、基因共表達(dá)分析

WGCNA（加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析），是一種分析多個樣本表達(dá)模式的分析方法。該分析方法旨在尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊(module)，并探索基因模塊與關(guān)注的表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，以及網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

利用之前研究的不同發(fā)育階段和不同組織部的WGCNA分析結(jié)果，找到了花器官發(fā)育特定模塊，其中包含107個基因。這些基因中10個為TFs，其中就包含已鑒定的Capana02g000700，這表明這些TFs可能與花發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。這107個基因中，發(fā)現(xiàn)9個基因與Capana02g000700高度共表達(dá)，分為3個家族，且其功能均與花發(fā)育相關(guān)。上述，均表明Capana02g000700通過抑制靶基因和/或TF表達(dá)來控制花器官發(fā)育，進(jìn)而影響花期。

圖7 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

1. 利用F2:3家系對F2群體表型進(jìn)行多年考查；
2. 利用BLUE分析解決當(dāng)不同年份的環(huán)境變化大的問題；
3. 利用WGCNA找到目標(biāo)性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和其中的核心基因。