葉霉病| 重測(cè)序BSA+KASP策略定位番茄抗病基因Cf-10

葉霉病，一種由番茄葉霉病菌引起的番茄病害，嚴(yán)重威脅著全球番茄的生產(chǎn)，并導(dǎo)致每年數(shù)百萬美元的經(jīng)濟(jì)損失；然而，番茄葉霉病菌抗性基因定位結(jié)合MAS策略是改良番茄抗病能力的一條有效途徑。截至目前，利用不同的遺傳材料已經(jīng)定位到許多番茄葉霉病菌基因或QTLs，但對(duì)于Cf-10基因定位的研究未見報(bào)道。

而本研究便集中于考察Cf-10抗病性的遺傳基礎(chǔ)，即運(yùn)用一種新的組合分析策略（重測(cè)序BSA：SNP-index與InDel-index共定位，結(jié)合KASP分型精細(xì)定位，圖1.）快速定位抗病基因Cf-10。首先，根據(jù)F1，F(xiàn)2與BC1F1抗/感病表型證明番茄葉霉病菌抗性受顯性單基因控制；通過對(duì)F2群體的抗/感病池重測(cè)序，并聯(lián)合運(yùn)用SNP-index與InDel-index的分析方法將Cf-10共定位在Chr 1.上的3.29Mb區(qū)間。接著，利用在此區(qū)間開發(fā)出的KASP標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位。隨后，Cf-10的定位區(qū)間縮短到790 kb，其中只有一個(gè)候選基因Solyc01g007130.3，此基因注釋為一個(gè)含有LRR基序的受體蛋白激酶。最后，通過RT-qPCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證Solyc01g007130.3為Cf-10候選基因。

圖1.?快速精細(xì)定位基因新的組合策略

研究結(jié)果

為考察Cf-10的遺傳基礎(chǔ)，作者對(duì)品種Ontario 792，Moneymaker及其F1，F(xiàn)2與BC1F1群體的抗病能力進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，品種Moneymaker對(duì)10種病菌生理小種表現(xiàn)敏感，而Ontario792均表現(xiàn)顯著抗病能力，暗示Ontario792對(duì)番茄葉霉病菌具有廣譜抗病能力；所有F1代個(gè)體均表現(xiàn)抗病，F(xiàn)2代抗病與感病個(gè)體呈現(xiàn)3:1分離比，暗示Cf-10受顯性單基因控制，并且BC1F1的表型分離比驗(yàn)證了這一結(jié)果（圖2.）。

圖2.?番茄葉片表型及其分離模式

? ? ? 為定位抗病基因Cf-10，作者采用BSA重測(cè)序結(jié)合SNP-index與InDel-index分析的方法進(jìn)行共定位。通過對(duì)雙親及2個(gè)極端混池高通量測(cè)序并分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)樣品間共有159,740個(gè)SNPs與74,988個(gè)InDels（圖3.A與B）。接著，利用SNP-index與InDel-index兩種方法定位Cf-10抗病QTLs，如圖3（C與D）所示，僅定位到1個(gè)QTL，并且這兩種關(guān)聯(lián)算法均將這個(gè)QTL錨定在Chr.1；不同的是，SNP-index定位區(qū)間為3.35Mb，而InDel-index為3.74Mb，二者共定位區(qū)間限定在3.29Mb。其中共有408個(gè)注釋基因，包括73個(gè)非同義基因，16個(gè)移碼基因與16個(gè)包含eLRR domain的基因。

圖3. SNP/InDel統(tǒng)計(jì)及BSA分析. A. SNP統(tǒng)計(jì)；B. InDel統(tǒng)計(jì)；C. SNP-index分析；D. InDel-index分析

? ? ? 由于3.29Mb區(qū)間仍包含大量基因，作者進(jìn)一步開發(fā)出16個(gè)KASP標(biāo)記，其中5個(gè)有效的KASP標(biāo)記用于147個(gè)單株（141個(gè)來自F2，6個(gè)來自F1，Ontario792?與Moneymaker）的基因分型。對(duì)Ontario792，Moneymaker與F1群體的KASP分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，暗示測(cè)序結(jié)果與KASP分型是可靠的。接著，利用遺傳圖譜及KASP標(biāo)記將定位區(qū)間鎖定在SNP1與SNP2之間（790kb，圖4.）。幸運(yùn)的是，這個(gè)區(qū)間只有一個(gè)注釋基因Solyc01g007130.3，編碼受體蛋白激酶TMK1，其中含有一個(gè)LRR基序，這是抗病基因的一般特征，暗示Solyc01g007130.3是Cf-10抗病候選基因。然而，基于重測(cè)序數(shù)據(jù)在兩親本間并沒有發(fā)現(xiàn)Solyc01g007130.3中存在SNPs或InDels，進(jìn)一步利用Sanger測(cè)序也沒有發(fā)現(xiàn)序列間差異。盡管如此，這并不能排除親本間存在甲基化修飾的差異，并且此基因上游啟動(dòng)子等調(diào)控序列可能也存在著變異。

圖4. SNP/InDel結(jié)合KASP標(biāo)記定位基因Cf-10

? ? ? 因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述定位結(jié)果，作者又通過RT-qPCR分析檢測(cè)候選基因Solyc01g007130.3在受病菌侵染的兩親本間的表達(dá)量差異，結(jié)果顯示，在抗病品種中此基因的表達(dá)量顯著高于感病品種，而在未感病時(shí)表達(dá)量并無明顯差異（圖5.）。結(jié)合以上結(jié)果，可以得出結(jié)論：基因Solyc01g007130.3就是Cf-10可能的抗病候選基因。

圖5. RT-qPCR分析候選基因Solyc01g007130.3的表達(dá)量（病菌侵染后）

研究結(jié)論

? ? ? 本研究采取一種新的組合策略（圖1.），即兩步信息分析SNP-index與InDel-index共定位，結(jié)合KASP標(biāo)記分型精細(xì)定位，快速定位到特定性狀候選基因，為克隆Cf-10基因以及分子標(biāo)記輔助育種提供一條強(qiáng)力有效的途徑。

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參考文獻(xiàn)：

Liu G, Zhao T, You X, Jiang J, Li J, Xu X. Molecular mapping of the Cf-10 gene by combining SNP/InDel-index and linkage analysis in tomato (Solanum lycopersicum). BMC Plant Biol. 2019 Jan 8;19(1):15.