全基因組甲基化測序分析

DNA甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記信息，獲得全基因組范圍內(nèi)所有C位點的甲基化水平數(shù)據(jù)，對表觀遺傳學(xué)的時空特異性研究具有重要意義。Bisulfite甲基化測序是以新一代高通量測序平臺為基礎(chǔ)，結(jié)合全基因組Bisulfite處理和生物信息數(shù)據(jù)分析技術(shù)，進(jìn)行低成本、高效率、高準(zhǔn)確度的全基因組DNA甲基化水平圖譜繪制。

堿基類型分布

堿基類型分布檢查用于檢測有無AT、GC分離現(xiàn)象。若無bisulfite處理，高通量所測序列為基因組隨機(jī)打斷后的DNA片段，由于位點在基因組上的分布是近似均勻的，同時，G/C、A/T含量也是近似均勻的。全基因組甲基化項目中經(jīng)過bisulfite處理后的基因組中大部分的C位點變成T位點，因此其中一條鏈出現(xiàn)T的含量增加而C的含量劇減，同時對應(yīng)的反向鏈出現(xiàn)A的含量增加而G的含量減少。

5mC檢測

5mC的檢測主要使用Bismark軟件工具包實現(xiàn)。由于樣品經(jīng)過重亞硫酸處理，基因組上所有的未甲基化的C位點轉(zhuǎn)換成了U；經(jīng)過PCR擴(kuò)增U->T;即基因組上未甲基化的C轉(zhuǎn)化成了T；而原本甲基化的C；沒有改變；相應(yīng)的負(fù)鏈G->A;bismark是專門用于甲基化處理的比對軟件；他會對reads進(jìn)行轉(zhuǎn)變；根據(jù)Clean Reads在參考基因組的最佳的比對結(jié)果，提取全基因組胞嘧啶（C）位點的比對堿基信息，最終得到5mC位點覆蓋統(tǒng)計。

染色體水平甲基化分布圖譜

在每條染色體上，以100K大小為一窗口來計算每個窗口的甲基化水平，繼而從染色體水平描述甲基化 C 堿基的分布情況，繪制全基因組染色體水平甲基化圖譜，可以很直觀的呈現(xiàn)出染色體某個區(qū)域甲基化水平。

高甲基化CGI區(qū)域注釋

對高甲基化密度的CGI區(qū)域進(jìn)行注釋，區(qū)域甲基化水平大于0.7我們認(rèn)為是高甲基化的CGI區(qū)域；同時我們把覆蓋度大于5X的C位點認(rèn)為是可信度較高的位點，去除CGI 區(qū)域內(nèi)可信度較高的C位點的比例小于0.1的CGI區(qū)域；對剩下的區(qū)域進(jìn)行注釋；取基因上游3000bp為promoter區(qū),進(jìn)行overlap注釋。

DMR相關(guān)GO基因分類注釋

DMR相關(guān)基因GO注釋分類統(tǒng)計圖，直觀的反映出在生物過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）
和分子功能（molecular function），所有基因和差異基因注釋GO term的個數(shù)分布。可深入挖掘DMR相關(guān)基因的功能及所在的信號通路，篩選關(guān)注差異基因注釋情況。

DMR關(guān)聯(lián)基因代謝通路分析

生物體內(nèi)，某些基因位點受到甲基化修飾之后，會影響該基因的表達(dá)，從而改變生物學(xué)表型。因此，對DMR關(guān)聯(lián)基因分別進(jìn)行GO和KEGG注釋及富集分析，有助于深入挖掘甲基化修飾引起的生物學(xué)功能變化。

成功案例

常見問題