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微生物多樣性測序分析

精準解析微生物種屬水平上的組成和豐度

產(chǎn)品介紹

微生物多樣性測序

微生物多樣性測序是對環(huán)境樣品中細菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA進行特定長度的PCR擴增并對擴增產(chǎn)物進行測序的分析，可實現(xiàn)對環(huán)境樣品中的優(yōu)勢物種、稀有物種和一些未知物種進行檢測，精準解析微生物在種屬水平上的組成和豐度情況，是當前研究環(huán)境微生物多樣性及群落組成差異的重要技術(shù)手段。

細菌微生物多樣性

16S?rDNA測序：16S?rDNA具有10個保守區(qū)和9個高變區(qū)。保守區(qū)反映生物物種間的親緣關系，高變區(qū)反映物種間的差異。對16S?rDNA某個高變區(qū)進行測序，用于研究環(huán)境微生物中的群落結(jié)構(gòu)多樣性。

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16S rDNA序列及常用擴增引物序列
真菌微生物多樣性

18S?rDNA測序：18S?rDNA也包含可變區(qū)和保守區(qū)。對18S?rDNA某個高變區(qū)進行測序，用于研究環(huán)境樣本中真核微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

ITS1測序：ITS分為兩個區(qū)域：ITS1和ITS2。ITS區(qū)域進化速率是18S rDNA的10倍之多。對ITS1和ITS2進行測序，用于研究環(huán)境樣本中真核微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

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ITS rDNA序列及常用擴增引物序列
功能基因多樣性

功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到廣泛關注的一類微生物，如硝化細菌、反硝化細菌、氨氧化細菌、硫酸鹽還原菌、固氮菌等，使這些功能細菌發(fā)揮這種特定功能的基因就稱為功能基因，如AOA、AOB、nifH等。

功能基因測序，是根據(jù)復雜環(huán)境中具有特殊功能的微生物基因序列設計引物，用該引物進行PCR擴增，建庫后進行高通量測序。功能基因測序可有效研究特定環(huán)境中的功能微生物物種信息，包括：功能微生物功能差異、分類和豐度等，并與每個采樣點的環(huán)境因子相結(jié)合，可以同時分析環(huán)境因子與功能細菌群落結(jié)構(gòu)的關系，因此對復雜環(huán)境中的微生物構(gòu)成研究有重要的指導作用。

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技術(shù)路線

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技術(shù)策略與送樣要求

測序策略

Illumina NovaSeq測序

?DNA送樣要求

DNA濃度≥1ng/ul，總量≥30ng，DNA電泳條帶清晰，無降解或者輕度降解。

環(huán)境樣品取樣方法及送樣要求

環(huán)境樣品 送樣要求 保存及運輸
普通土壤 除去土壤表層未分解的凋落物層、動植物殘體、石礫等雜質(zhì)，將大塊的樣品搗碎，過2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。 樣本-80℃或液氮中長期保存，干冰運輸
根際土壤 收集植物植株，去除根部大塊土壤；搖動植株去除附著不緊密的土壤，使用無菌刷子收集根部附著緊密的土壤；隨機多點取樣5-10g，過2mm篩后，分裝至2mL或更大體積的EP管或凍存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保證送樣量在1~2g。
糞便 無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段內(nèi)部（避免表層中的腸道膜脫落細胞），外部容易污染且細菌DNA由于接觸空氣可能有降解。將已取的糞便樣品分裝至2mL?EP管（無菌）或凍存管（無菌）中，每管糞便量為0.5~2g，每個樣品分裝2~3管備份。
腸道內(nèi)容物 在實驗對象死亡后，無菌條件下，取出整個腸道，用無菌解剖刀切取所需腸段的，用無菌手術(shù)刀挖取內(nèi)容物分裝至2mL?EP管（無菌）或凍存管（無菌）中，每管組織量為0.5~2g，每個樣品分裝2~3管備份
水體 過濾大量低微生物含量的清亮水樣用0.22μm?的聚苯醚砜濾膜，每個樣本至少1L水樣。渾濁水樣使用0.22μm濾膜過濾緩慢容易堵塞時，建議使用0.45μm的混合纖維素酯濾膜，每個樣本0.5L-1L水樣；如果水樣中不可溶解的顆粒較多，需要使用2-5μm孔徑的濾膜將不可溶解的顆粒雜質(zhì)濾去，再使用0.22μm或0.45μm的濾膜富集菌體，每個樣本0.5L-1L水樣。
空氣 開動采樣儀（浮游細菌采集器），使被測空氣濾過凝膠膜（滅菌），空氣中的浮游菌被截留在凝膠膜上（過濾時間越長，收集的空氣中的灰塵越多，菌數(shù)量越多），收集完成后取下濾膜。

產(chǎn)品優(yōu)勢與項目經(jīng)驗

高水平分析團隊

豐富的項目經(jīng)驗

全面的分析內(nèi)容

專業(yè)的售后服務

數(shù)據(jù)質(zhì)控

數(shù)據(jù)下機后根據(jù)PE reads之間的Overlap關系，將Hiseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(Merge)成一條序列Tags，同時對Reads的質(zhì)量和Merge的效果進行質(zhì)控，主要包括去除低質(zhì)量Tags和去嵌合體

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物種注釋

根據(jù)97%的相似度進行OTU聚類后，基于Silva（細菌）和UNITE（真菌）分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋，得到每個OTU對應的物種分類信息，進而在各水平（phylum，class，order，family，genus，species）統(tǒng)計各樣品群落組成，繪制樣品在各分類學水平下的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖，柱狀圖展示不同樣品中物種的組成和相對豐度。

Alpha多樣性分析

Alpha多樣性（Alpha diversity）反映的是單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，有多種衡量指標：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指數(shù)簡單的反映出群落中物種的數(shù)量；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量群落多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度（Community evenness）的影響。Chao1、Ace、Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高。另外還統(tǒng)計了樣本文庫的覆蓋率 Coverage，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。

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weighted unifrac

Beta多樣性分析

Beta多樣性分析主要采用 binary jaccard、 bray curtis、 weighted unifrac(限細菌)、 unweighted unifrac (限細菌)等4種算法計算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值。這四個算法主要分為兩大類：加權(quán)（Bray-Curtis和Weighted Unifrac）與非加權(quán)（Jaccard和Unweightde Unifrac）。利用非加權(quán)的計算方法，主要比較的是物種的有無；而加權(quán)方法，則需要同時考慮物種有無和物種豐度兩個問題。樣品間距離越小，說明兩個群體的物種組成越相似。

LEfSe分析

LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析主要用于發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計學差異的Biomarker，根據(jù)設定的Biomarker篩選標準（LDA score>4）找出符合條件的Biomarker。

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主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）

PCA是一種分析和簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過將方差進行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，通過分析不同樣品 OTU（97%相似性）組成可以反映樣品的差異和距離，PCA運用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能夠最大反映方差的兩個特征值。圖中兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似。

16S功能預測

16S功能預測基于PICRUSt軟件通過比對16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

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相關性分析

網(wǎng)絡圖是相關性結(jié)果的一種表現(xiàn)形式，根據(jù)各個物種在各個樣品中的豐度以及變化情況，使用sparcc算法進行相關分析，圖中線的粗細代表相關性的強弱；線的顏色表示相關性：紅色代表正相關，綠色代表負相關。

成功案例展示

案例一

Degradation of polyethylene plastic in soil and effects on microbial community composition

發(fā)表時間：2021

合作單位：西北農(nóng)林科技大學

發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials

研究背景：全球土壤系統(tǒng)中的塑料污染正成為一個嚴重的全球性問題，對陸地生態(tài)系統(tǒng)服務和人類健康構(gòu)成潛在威脅。為了確定聚乙烯薄膜的降解性和生態(tài)效應，本研究以小麥為試材，通過盆栽試驗，研究塑料降解與土壤微生物群落組成之間的相互作用。

測序策略： 16S V3+V4 Illumina Hiseq 2500 PE250

研究結(jié)論：不同條件下的PE膜具有獨特的降解性能，改變了土壤微生物群落組成。此外，在塑料薄膜上形成了一個巨大的獨特的微生物群，這可能會改變土壤的基本性質(zhì)。PE膜可能是一種獨特的微生物定殖基質(zhì)，可能促進其自身降解，改變生物地球化學過程和土壤生態(tài)功能。

參考文獻： Daofen Huang, Yibo Xu, Fadan Lei, Xiaoqin Yu, Zhuozhi Ouyang, Yanhua Chen, Hanzhong Jia, Xuetao Guo,Degradation of polyethylene plastic in soil and effects on microbial community composition,Journal of Hazardous Materials,2021

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不同條件下微生物群落中共有和特有OTUs的維恩圖
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不同條件下微生物群落結(jié)構(gòu)三元相圖
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不同條件下微生物門水平相對豐度

案例二

Nitrogen removal mechanism of marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater in response to ultraviolet (UV) irradiation: High UV tolerance and microbial community shift

發(fā)表時間：2021

合作單位：青島大學

發(fā)表期刊： Bioresource Technology

研究背景：海洋厭氧氨氧化菌(MAB)可以自然克服鹽脅迫，但其生長速率低、對操作條件敏感仍是應用厭氧氨氧化的挑戰(zhàn)。為增強MAB的富集，深入了解紫外線輻照與MAB的關系，將紫外線引入MAB脫氮工藝中，研究MAB在不同紫外線劑量下處理含氮含鹽廢水的脫氮機理，分析不同紫外線劑量引起的胞外多聚物(EPS)含量、關鍵酶活性和微生物群落組成及紫外線照射下微生物預測功能的動態(tài)探討。

測序策略： 16S V3+V4 Illumina Hiseq 2500 PE250

研究結(jié)論：在處理含氮鹽漬廢水中，念珠菌對UV-C輻照的耐受性較高，可達12000 mJ/cm2。在此劑量下，微生物豐富度增加，多樣性降低，MAB的相對豐度提高了1.2倍。過量的EPS產(chǎn)量和厭氧氨氧化菌的特殊結(jié)構(gòu)是維持紫外輻射下厭氧氨氧化活性的兩條防線。

參考文獻： Yuanyuan Gao, Jin Li, Huiyu Dong, Zhimin Qiang,Nitrogen removal mechanism of marine anammox bacteria treating nitrogen-laden saline wastewater in response to ultraviolet (UV) irradiation: High UV tolerance and microbial community shift,Bioresource Technology,2021

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實驗設計
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門水平微生物群落結(jié)構(gòu)
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KEGG數(shù)據(jù)庫微生物功能預測分析
Q1.微生物多樣性中OTU是指什么？

OTU（Operational Taxonomic Unit ）即分類操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學研究或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，種，屬，分組等）設置的同一標志。在微生物多樣性分析中，根據(jù)不?同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，一般情況下，如果序列之間的相似性高于97%?（種水平）就可以把它定義為一個OTU，每個OTU代表一個物種。

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Q2.Beta多樣性四種距離算法的差異？

Beta 多樣性分析主要采用 binary jaccard、 bray curtis、 unweighted Unifrac(限細菌)、weighted Unifrac (限細菌)等4種算法計算樣品間的距離，那么這四種算法都有什么差別呢？

非加權(quán)的計算方法，主要考慮的是物種的有無，即如果兩個群體的物種類型都一致，表示兩個群體的樣本距離最??；加權(quán)方法，則同時考慮物種有無和物種豐度兩個問題。比如如樣品A由3個物種a和2個物種b組成，樣品B由2個物種a和3個物種b組成，則通過非加權(quán)方法計算，因為樣品A與樣品B的物種組成完全一致，都只由物種a和b組成，因此它們之間的樣本距離為0。但通過加權(quán)方法計算，雖然樣品A與樣品B的物種組成一致，但物種a和b的數(shù)目卻不同，因此兩個群體的β多樣性則并非一致。

基于獨立OUT的方法認為OTU之間不存在進化上的聯(lián)系，每個OTU間的關系平等；基于系統(tǒng)發(fā)生樹計算的方法，會根據(jù)16s的序列信息對OTU進行進化樹分類， 因此不同OTU之間的距離實際上有“遠近”之分。

Q3.PCA與PCoA的區(qū)別？

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一種分析和簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過將方差進行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上；主坐標分析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一種與 PCA 類似的降維排序方法。PCoA與PCA的區(qū)別在于PCA是基于原始的物種組成矩陣所做的分析，使用的是歐式距離，僅僅比較的是物種豐度的不同，而PCoA首先根據(jù)不同的距離算法計算樣品之間的距離，然后對距離矩陣進行處理，使圖中點間的距離正好等于原來的差異數(shù)據(jù)，實現(xiàn)定性數(shù)據(jù)的定量轉(zhuǎn)換。