外顯子是基因組中能夠轉(zhuǎn)錄組出成熟RNA的部分，外顯子組(exome)是基因組中所有外顯子的集合。人類擁有約18萬個外顯子，約占人類基因組的1%，即約3000萬個bp(30MB)。全外顯子組測序是指通過探針捕獲基因組中外顯子區(qū)域的DNA序列，并進(jìn)行集中測序分析，從而找到致病變異或鎖定與疾病相關(guān)的基因，對于遺傳性疾病及腫瘤等病變病理成因確認(rèn)以及治療靶點鎖定有重要作用。
沈陽醫(yī)學(xué)院高兵教授團(tuán)隊在?Redox Biology?雜志發(fā)表題為“ Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation ”?的研究論文，結(jié)合全外顯子測序與轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)數(shù)據(jù)分析，解釋ATP1A1在腎晶體形成中起到的重要作用，表明ATP1A1可能是治療鈣結(jié)石的潛在治療靶點。ong>
英文標(biāo)題：Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation
中文標(biāo)題：腎結(jié)石病的Meta數(shù)據(jù)分析揭示ATP1A1參與腎晶體形成
發(fā)表期刊：Redox Biology
合作單位：沈陽醫(yī)學(xué)院
影響因子：10.7
研究對象：CaOx腎結(jié)石患者及對照組樣本
研究方法：全外顯子測序（WES）+表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析
百邁客生物為該研究提供了外顯子測序服務(wù)。
研究背景
腎結(jié)石在全球范圍內(nèi)都威脅著人類的生命健康，近年來發(fā)病率和復(fù)發(fā)率都不斷上升，大多數(shù)腎結(jié)石由草酸鈣（Calcium ox）結(jié)石組成，晶體-細(xì)胞粘附被認(rèn)為是晶體保留和結(jié)石形成中的關(guān)鍵步驟，有研究報道，受損的腎小管上皮細(xì)胞對晶體附著的親和力增加，而晶體沉積通過產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）反過來又誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。Na/K-ATPase（NKA）是一種在腎臟中高度表達(dá)的跨膜離子泵，同時其由ATP1A1編碼的α1亞基也起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器的作用，當(dāng)?ATP1A1?構(gòu)象改變或被敲低時，Src 就會被磷酸化并激活下游信號級聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致 ROS 的產(chǎn)生，ROS可以激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)和NF-κB炎癥反應(yīng)，并作為ATP1A1的配體啟動ATP1A1/Src信號通路，從而形成NKA/ROS擴(kuò)增環(huán)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，然而，ATP1A1在腎結(jié)石形成中的作用尚不清楚。本實驗結(jié)合多組學(xué)分析方法，以期提供一種有用的方法，研究腎結(jié)石形成病理。
材料方法
實驗材料：28例中國漢族CaOx腎結(jié)石患者及對照組樣本
組學(xué)方法：全外顯子測序（WES）+表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析
研究結(jié)果
首先該研究從GEO數(shù)據(jù)中獲取了腎臟鈣結(jié)石患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)化，其中患者的RP組織（Randall斑塊）命名為P組，患者的正常組織命名為N組，對其表達(dá)譜篩選基因進(jìn)行WGCNA分析，選擇與樣本相關(guān)性較高的淺橙色模塊（434個基因）進(jìn)行后續(xù)研究，GO富集結(jié)果表明這些基因在質(zhì)膜和跨膜轉(zhuǎn)運中富集。KEGG富集分析顯示，這些基因參與“醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收”、“礦物質(zhì)吸收”、“內(nèi)分泌等因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收”和“近端小管碳酸氫鹽回收”等通路，進(jìn)一步查看發(fā)現(xiàn)，FXYD2、FXYD4、ATP1A4、ATP1A1和ATP1B1等5個編碼NKA的基因參與了跨膜轉(zhuǎn)運、吸收和重吸收的過程，表明NKA可能與腎結(jié)石密切相關(guān)。
為進(jìn)一步探究腎結(jié)石相關(guān)關(guān)鍵基因，該研究對28例中國漢族CaOx結(jié)石患者進(jìn)行了WES分析，共鑒定得到76個SNPs，其中錯義SNPs31個，編碼同義SNPs30個，3′UTR7個SNPs，5′UTR區(qū)8個SNPs，作為候選SNPs，這些突變位點定位于67個基因，將這67個基因與WGCNA分析中的434個基因做韋恩圖取交集，發(fā)現(xiàn)ATP1A1是兩個數(shù)據(jù)集交叉點中的唯一基因，一定程度上說明了ATP1A1在鈣結(jié)石形成中的潛在作用。
接下來，該研究從WES數(shù)據(jù)中提取了ATP1A1的SNP，rs11540947 T等位基因在患者組中的突變頻率頻率為16.1%，而對照組僅為2.4%。為進(jìn)一步證實rs11540947與鈣結(jié)石形成的相關(guān)性，收集214例鈣結(jié)石患者和232例匹配對照，通過HRM分析檢測rs11540947的基因型，結(jié)果顯示，CT+TT攜帶者在患者中比對照組更常見，且在男性中與鈣結(jié)石有關(guān)，但在女性中無顯著相關(guān)性，SNPrs11540947 （NM_000701:c.-78C > T）位于?ATP1A1?的 5′UTR 中；在ATP1A1的5′UTR中發(fā)現(xiàn)了Sp1結(jié)合位點和潛在的TATA盒，表明5′UTR具有啟動子活性，雙熒光素酶報告基因結(jié)果也證明了這一點，rs11540947的T等位基因介導(dǎo)了ATP1A1啟動子活性的顯著降低，這可能會降低ATP1A1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。對草酸鈣一水合物（COM）暴露處理的HK2細(xì)胞（人腎近曲小管上皮細(xì)胞）進(jìn)行指標(biāo)測定，結(jié)果顯示處理3h后，NKA酶活性和ATP1A1 mRNA水平顯著下降，6h后ATP1A1的蛋白水平升高，隨后降低，同時COM 暴露后細(xì)胞內(nèi) ROS 水平顯著增加，這可能與ATP1A1/Src信號通路的激活有關(guān)，而ATP1A1的過表達(dá)抑制了COM誘導(dǎo)的Src、p38、JNK、p65和p50激活；WB結(jié)果也顯示COM激活的半胱天冬酶3被ATP1A1的過表達(dá)以及ATP1A1/Src信號復(fù)合物的特異性拮抗劑pNaKtide顯著抑制，從而阻斷了細(xì)胞凋亡過程。
晶體與細(xì)胞的粘附是結(jié)石形成的關(guān)鍵過程，晶體沉積會損傷腎細(xì)胞，因此，作者研究了ATP1A1在晶體-細(xì)胞粘附中的作用。該研究觀察到用 Ad-hATP1A1 感染和用 pNaKtide 處理后，Ca2+濃度與對照組相比顯著降低，表明ATP1A1過表達(dá)和pNaKtide可以阻止晶體與細(xì)胞的粘附，從而保護(hù)細(xì)胞免受CaOx晶體誘導(dǎo)的損傷并減少腎結(jié)石的形成。DNA啟動子中CpG島的甲基化是基因沉默的常見機(jī)制，COM暴露后，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著升高，而用DNA甲基化抑制劑5Aza-2dc預(yù)處理HK2細(xì)胞再進(jìn)行COM暴露處理后，ATP1A1表達(dá)量下調(diào)；ATP1A1的蛋白水平也被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，改變的DNA甲基化參與了COM誘導(dǎo)的ATP1A1降低。
為了證實ATP1A1對體內(nèi)晶體形成的影響，該研究構(gòu)建了CaOx腎病大鼠模型，用 pNaKtide 治療后尿草酸鹽排泄量顯著減少，與體外研究結(jié)果類似，HYP+CaCl2處理降低了 ATP1A1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，激活了 Src、p38、JNK、p65 和 p50，降低 Nrf2 表達(dá)，而這些均被pNaKtide逆轉(zhuǎn)，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了ATP1A1和ATP1A1/Src信號通路在腎結(jié)石形成中的重要性。
研究總結(jié)
綜上所述，該研究從遺傳水平和環(huán)境因子影響的轉(zhuǎn)錄水平探究腎結(jié)石相關(guān)關(guān)鍵易感基因，將鈣結(jié)石形成者Randall斑塊（RP）組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)與CaOx患者的WES數(shù)據(jù)相結(jié)合，鑒定出ATP1A1這一關(guān)鍵基因，還研究了ATP1A1遺傳變異與鈣結(jié)石風(fēng)險的關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步探討了ATP1A1/Src/ROS信號在體外和體內(nèi)腎結(jié)石形成中的作用，這項研究的發(fā)現(xiàn)揭示了ATP1A1基因變異及其表達(dá)降低參與腎晶體形成的機(jī)制，可能為CaOx結(jié)石提供潛在的治療靶點。
參考文獻(xiàn)：
Li Y, Lu X, Yu Z, Wang H, Gao B. Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation.?Redox Biol. 2023 May;61:102648. doi: 10.1016/j.redox.2023.102648. Epub 2023 Feb 27. PMID:36871182.
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