空間轉(zhuǎn)錄組樣本制備要求

1、前言

1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實(shí)驗(yàn)平臺空間轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請?jiān)敿?xì)閱讀。

1.2 聲明

我國法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結(jié)膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細(xì)菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國家的相關(guān)規(guī)定，為嚴(yán)格遵守國家法律法規(guī)，本著對社會及相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)的態(tài)度，我司要求客戶方真實(shí)準(zhǔn)確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進(jìn)行事先說明。樣品中含有上述感染性病原體時，客戶方需要提供符合生物安全等級要求的實(shí)驗(yàn)室以便開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時，客戶方有義務(wù)協(xié)助我方實(shí)驗(yàn)員做好實(shí)驗(yàn)安全防護(hù)?？蛻舴讲坏秒[瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目，已產(chǎn)生的費(fèi)用由客戶方承擔(dān)。如因客戶方提供的生物安全性信息不實(shí)、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實(shí)驗(yàn)員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴(yán)重后果的，我司將按規(guī)定報告國家相關(guān)部門，并將通過法律等手段追究相關(guān)責(zé)任。

2、項(xiàng)目流程

目前百邁客空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)模式默認(rèn)為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門服務(wù)，請與百邁客技術(shù)人員確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備情況。組織寄送前請至少提前 1 周進(jìn)行預(yù)約，百邁客接收到樣本并確認(rèn)樣本無異常后，3-5 天內(nèi)安排 RNA 質(zhì)檢并反饋質(zhì)檢結(jié)果，質(zhì)檢合格后安排切片、組織結(jié)構(gòu)確認(rèn)與透化。

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x 空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長寬不宜超過 6.5*6.5mm2，百創(chuàng) S1000 空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長寬不宜超過 6.8*6.8mm2，厚度＞1.5mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個包埋成一個 OCT 包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面充分利用捕獲區(qū)域。

注 1：在樣本量足夠的情況下，每個動物樣本最好準(zhǔn)備至少 2 個包埋塊，1份用于 RNA 質(zhì)檢（切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見第 3.3 部分）、切片選片、上透化芯片和表達(dá)芯片，另 1 份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項(xiàng)目周期。

注 2：在樣本量足夠的情況下，每個植物樣本最好準(zhǔn)備至少 3-5 個包埋塊，因植物組織目的結(jié)構(gòu)較薄，RNA 質(zhì)檢（切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見第 3.3 部分）、切片選片、上透化芯片和表達(dá)芯片，需各準(zhǔn)備一個包埋塊。避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項(xiàng)目周期。

3.2 樣本采集與運(yùn)輸

3.2.1 采集前準(zhǔn)備

1) 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預(yù)冷；

2) 在醫(yī)用托盤上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無菌布，將個體放在無菌布上進(jìn)行取樣，保持整個取樣過程在低溫中進(jìn)行，可以延緩核酸的降解，（動物組織建議針對活體或剛死亡個體進(jìn)行解剖取樣）；

3) 動物組織如果取樣后無法立即進(jìn)行后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn)，可以將樣本清理干凈后，暫時放入組織保護(hù)液（美天旎，貨號130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時間最長不要超過5h，以免造成RNA降解，RIN值質(zhì)檢不合格；

4) 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）進(jìn)行包埋，OCT使用前在冰上預(yù)冷30分鐘。

3.2.2 動物樣本采集

1) 取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）；

2) 迅速用預(yù)冷的 PBS 溶液（RNase free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無菌紗布吸凈表面液體；

3) 如果組織體積較大，需要將組織切成長寬＜6.5*6.5mm2（10x Genomics）/6.8*6.8mm2（百創(chuàng)S1000）的小塊，用7*7*5mm2的特小號包埋盒進(jìn)行包埋；取下的組織應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn)。

注：原則上實(shí)驗(yàn)室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運(yùn)營確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運(yùn)送，實(shí)驗(yàn)室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3 植物樣本采集

1) 在無菌超凈臺中處理組織，從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成＜6.5*6.5mm2（10x Genomics）/6.8*6.8mm2（百創(chuàng)S1000）的小塊；

2) 利用預(yù)冷的蒸餾水將組織沖洗 3 次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液，用7*7*5mm2的特小號包埋盒立即進(jìn)行包埋；

注：原則上實(shí)驗(yàn)室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運(yùn)營確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運(yùn)送，實(shí)驗(yàn)室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4 動物組織速凍包埋

下文提供了 2 種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結(jié)果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護(hù)細(xì)胞完整性，但操作較復(fù)雜，而且異戊烷對人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進(jìn)行冷凍包埋。

方法 1 干冰包埋法（常用）

無需異戊烷，直接用干冰粒進(jìn)行包埋。

1) 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；

2) 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；

3) 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷 OCT，避免產(chǎn)生氣泡；

4) 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入 OCT 中，調(diào)整好方向，用 OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT 冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；

5) 將包含組織和 OCT 的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達(dá)到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結(jié)變白（如下圖，右）。

6)?將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運(yùn)輸。

方法 2 異戊烷+液氮包埋法

異戊烷液氮不接觸新鮮組織冷凍和 OCT 包埋同時進(jìn)行。

1) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 15 分鐘；

2) 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；

3) 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；

4) 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷 OCT，避免產(chǎn)生氣泡；

5) 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入 OCT 中，調(diào)整好方向，用 OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT 冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；

6) 用鑷子將包埋盒放到異戊烷中，但不要使異戊烷浸入包埋盒內(nèi)，直到組織凍結(jié)，冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化；

7) 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運(yùn)輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據(jù)植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一：固定+抽真空

1) 將植物組織浸泡在 1ml 0.05%吐溫 20 中,室溫 15min

2) 將植物組織浸泡在 1ml 預(yù)冷的 EAA（無水乙醇：乙酸 3:1）中，抽真空 10min，固定組織。

3) 將組織轉(zhuǎn)入新的加入了 1ml 預(yù)冷的 10%蔗糖溶液（用 1X PBS 配制）的 EP管中（此時組織漂浮在液面上），抽真空 20min。小心取出 EP 管并蓋緊，注意不要搖晃讓溶液中混入空氣，在 4℃中震蕩至少一個小時，直至組織沉底。

4) 取出 EP 管，去除其中溶液，加入預(yù)冷的 20%蔗糖溶液（用 1X PBS 配制），重復(fù)操作 3。

5) 按照組織個數(shù)，室溫下，用 OCT 包埋劑填滿包埋盒，注意盡量不要產(chǎn)生氣泡，并在包埋盒上寫上樣品名稱做好標(biāo)記（可拍照記錄）。

6) 取出 EP 管置于冰上，將放在蔗糖溶液中的組織取出，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液?？紤]到植物組織，如莖桿中的維管束本身就存在空隙，所以盡量不要吸干整個組織中的蔗糖溶液，防止空氣進(jìn)入。用鑷子輕輕夾住組織，緩慢放入 OCT 包埋劑中，直至 OCT 完全包裹組織，如果有氣泡可以用移液器將氣泡吸出。室溫下靜止 20-30min，使殘留的蔗糖溶液與 OCT 充分融合。

7) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5- 10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結(jié) 。

8) 調(diào)整組織在 OCT 中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標(biāo)平面與切面水平一致。如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用 200 μl 槍頭吸出氣泡。

9) 用鑷子夾住包埋盒置于預(yù)冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待 OCT 凝固變白。

10) 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標(biāo)記，利用干冰運(yùn)輸。

方法二 ：抽真空+異戊烷冷凍 OCT 包埋（不需要固定）

1) 在無菌超凈臺中處理，從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中 ，利用 4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成 6.5*6.5mm 大小 ，去除植物組織目標(biāo)區(qū)域之外其余組織，空隙較多組織（花苞、莖尖）將組織部分切開利用預(yù)冷的蒸餾水將組織沖洗 3 次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液 。

2) 將植物組織浸泡在 1ml 0.05%吐溫 20 中,室溫 15min。

3) 冰上預(yù)冷 75% OCT 包埋劑溶液（7.5mlOCT+2.5ml 滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入 500 μl 75%的 OCT，將植物組織浸潤在其中，將平底的無吸附膜的吸附柱放入 1.5ml 離心管中，以防止抽真空過程組織上浮在 OCT 表面，打開所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空 10min，摸索設(shè)置成 V-AQ，促進(jìn) OCT 溶液充分包裹和進(jìn)入組織空隙中，保證 OCT 填充包埋組織的完整性。如下圖：

4) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5- 10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結(jié) 。

5) 將包埋盒放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的 OCT 包埋劑，約 1/4 深度 ，微凝固后待用，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

6) 在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的 OCT，緩慢放入預(yù)冷的含 OCT的包埋盒中 ，加預(yù)冷的 OCT 直至完全包裹組織，并調(diào)整組織在 OCT 中的位置 ，保證目標(biāo)平面與切面水平一致，如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用 200 μl 槍頭吸出氣泡。

7) 用鑷子夾住包埋盒置于預(yù)冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待 OCT 凝固變白。

8) 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標(biāo)記，利用干冰運(yùn)輸。

方法三 ：直接冷凍 OCT 包埋（不需要固定 ，不需要抽真空）

1) 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5- 10 分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結(jié) 。

2) 將包埋盒（冷凍切片 OCT 包埋盒 ，7x7x5mm，實(shí)際尺寸是 10 x 10 x 5mm）放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的冰上預(yù)冷的 OCT 包埋劑，約 1/4 深度，微凝固后待用，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

3) 在無菌超凈臺中處理組織，從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中 ，利用 4 度預(yù)冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成 6.5*6.5mm 大小 ，去除植物組織目標(biāo)區(qū)域之外其余組織，利用預(yù)冷的蒸餾水將組織沖洗 3 次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液 。

4) 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預(yù)冷的 OCT 包埋劑中 ，直至 OCT完全包裹組織。

5) 調(diào)整組織在 OCT 中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標(biāo)平面與切面水平一致。如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用 200 μl 槍頭吸出氣泡。

6) 用鑷子夾住包埋盒置于預(yù)冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待 OCT 凝固變白。取出包埋盒并放入-80℃保存（在室溫下，異戊烷溫度會迅速升高，冷凍過程中一旦異戊烷升溫，需要馬上置于液氮中重新冷卻）或直接進(jìn)行切片。冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化。

7) 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標(biāo)記，利用干冰運(yùn)輸。

3.2.6 樣本寄送運(yùn)輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長期保存，或者放置在干冰上進(jìn)行冷凍運(yùn)輸，寄送到百邁客實(shí)驗(yàn)室，干冰寄送推薦用量約 5kg/日。

不規(guī)范送樣示例：

A.包埋時組織放置靠近最下層，組織未被 OCT 包裹，導(dǎo)致樣本 RNA 降解，質(zhì)檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導(dǎo)致樣本降解，組織兩側(cè)無 OCT 支撐，展片時可能會破壞樣本結(jié)構(gòu)；

C.組織較小，不滿足做表達(dá)最小 25%的要求；

D.同一個包埋塊包埋了多個樣本，但不在同一個平面，并且每一個樣本組織過小，覆蓋區(qū)域有限，可能導(dǎo)致分析有效數(shù)據(jù)偏低。

3.3 切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

組織形態(tài)學(xué)檢測：對切片進(jìn)行 H&E 染色，觀察是否獲取到目標(biāo)區(qū)域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內(nèi)（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。

RNA 完整性檢測：取 10-15 張切片，利用 Agilent2100 對樣本進(jìn)行 RNA 完整性檢測，要求 RNA RIN≥7，則認(rèn)為樣本完整性滿足實(shí)驗(yàn)要求，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體切片質(zhì)檢量如下：

1）10 微米切片厚度，組織占包埋塊面積的 1/5-1/4，質(zhì)檢量要求~15 張（左圖）；

2）10 微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質(zhì)檢量要求~10 張（右圖）。

3.4 測序數(shù)據(jù)量推薦

測序數(shù)據(jù)量：推薦 60G/樣；

測序平臺：NovaSeq 6000（PE150）。

4、FFPE 樣本

4.1 樣本要求

1）目前 10x Genomics FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組適用物種為人和小鼠，用于 FFPE 樣本的捕獲區(qū)域?yàn)?6.5*6.5mm2，若組織塊超過 6.5*6.5mm2，則需要對樣本進(jìn)行劃割，確定目標(biāo)區(qū)域?yàn)?6.5*6.5mm2內(nèi)；

2）在樣本量足夠的情況下，每個樣本最好準(zhǔn)備至少 2 個石蠟塊，1 份用于質(zhì)控和正式實(shí)驗(yàn)，另 1 份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項(xiàng)目周期。

4.2 樣本寄送運(yùn)輸

石蠟包埋好組織塊放在密閉的容器中，4℃寄送，低溫運(yùn)輸以確保 RNA 的完整性。

4.3 切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

FFPE 空間實(shí)驗(yàn)啟動前需要從石蠟切片中提取 RNA 進(jìn)行 DV200 的質(zhì)檢和在Test 玻片上貼片測試組織的粘附性。當(dāng) DV200＞50%且組織粘附性高時，實(shí)驗(yàn)成功率更高，因此若有多余的蠟塊可送備份從而保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

1）提取 RNA 檢測 DV200：要求 DV200≥50%，DV200 檢測表示大于 200 個核苷酸的 RNA 片段占所有 RNA 片段的百分比，指控合格可以表明 RNA 沒有片段化嚴(yán)重，降解程度較輕，RNA 完整性較高；

檢測 DV200 樣本量要求：10 微米切片厚度，截面積＞50mm2，~5 張；截面積＜50mm2，~10 張。

2）組織粘附性：石蠟樣本容易脫片，需要在 Test 玻片上貼片測試組織的粘附性，是否脫片，組織粘附性高時，實(shí)驗(yàn)成功率更高。

粘附性樣本量要求：兩個樣本測試一張 Test 芯片（此芯片是 10x 定制的芯片），每個樣本需要 4 張切片。

4.4 測序數(shù)據(jù)量推薦

測序數(shù)據(jù)量：推薦 60G/樣；

測序平臺：NovaSeq 6000（PE150）。