代謝合成途徑研究進(jìn)展 | 抗AD藥物石杉?jí)A甲的生物合成途徑解析

期刊名稱(chēng)：PNAS

影響因子：12.779

合作單位：斯坦福大學(xué)

研究部位：根、莖、葉、枝條

研究方法：轉(zhuǎn)錄組、代謝組、體外酶活

研究背景

2021年6月，斯坦福大學(xué) Elizabeth S. Sattely 團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》PNAS發(fā)表一項(xiàng)重要研究成果，題為：A metabolic regulon reveals early and late acting enzymes in neuroactive Lycopodium alkaloid biosynthesis。研究通過(guò)代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，確定了一組發(fā)育受控的生物合成基因，或潛在的調(diào)節(jié)子，用于調(diào)控石松生物堿的生物合成。

植物合成了許多能影響哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小分子化合物，成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物先導(dǎo)的重要來(lái)源。一些重要神經(jīng)活性植物代謝物是賴(lài)氨酸衍生的生物堿，但植物合成這類(lèi)化合物的機(jī)制在很大程度上仍未被闡明。為了更好地理解植物如何合成這些代謝物，作者團(tuán)隊(duì)聚焦于傳統(tǒng)草藥石松（Club moss）Phlegmariurus tetrastichus中石松生物堿（Lycopodium alkaloids）的生物合成研
究。迄今已報(bào)道發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種石松生物堿，包括乙酰膽堿酯酶抑制劑石杉?jí)A甲（Huperzine A，HupA），其作為阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）治療藥物引起了科學(xué)家廣泛的研究興趣。

實(shí)驗(yàn)材料

Phlegmariurus屬（以前被歸類(lèi)為石杉屬）的品種：P. brassii，P. carinata，P. goebelli，P. salvinoides，P. squarrosus和P. tetrastichus，所有植物均在室溫和光照下生長(zhǎng)，并偶爾通過(guò)去離子水（DI）噴灑其根部來(lái)澆水。每周一次，向植物提供直接施用于根部的營(yíng)養(yǎng)液（Ionic Grow for Soil 3-1-5，Hydrodynamics International）。用于異源基因表達(dá)的本氏煙草植株在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度下，在生長(zhǎng)燈下以 16/8 小時(shí)的光/暗循環(huán)在 PRO MIX HP 菌根土壤（Premier Tech Horticulture）中生長(zhǎng)。選擇植物在萌發(fā)后 4 至 5 周進(jìn)行
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。

1、轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)

取根、莖、葉、枝條，每組3個(gè)重復(fù)。

2、代謝組實(shí)驗(yàn)

取根、莖、葉、枝條，每組3個(gè)重復(fù)。

研究結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)錄組分析——石松生物堿生物合成研究

為了指導(dǎo)對(duì)石松生物堿生物合成的研究，作者重點(diǎn)關(guān)注 HupA，因?yàn)樗阎哂凶鳛?AChE 抑制劑的活性和作為藥物的潛力。HupA 由石松屬內(nèi)的物種產(chǎn)生，但這些物種的 HupA 積累水平差異很大。作者推斷物種中 HupA 的增加可能與上調(diào)的生物合成基因表達(dá)有關(guān)。因此，檢測(cè)了石松屬的幾個(gè)物種的 HupA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P. tetrastichus（圖 2A）積累了 HupA 到最高水平。因此，后續(xù)的研究將集中在該物種上。之前的研究表明，從頭 HupA 生物合成對(duì)P. tetrastichus枝條的新生長(zhǎng)具有特異性，接著作者通過(guò)氘同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，并且發(fā)現(xiàn)與莖相比，HupA標(biāo)記在葉中更廣泛分布，表明這里的生物合成基因表達(dá)富集（圖2B）。因此，作者對(duì)對(duì)該物種的多個(gè)組織進(jìn)行了RNA-seq分析，揭示石杉生物堿生物合成基因在活性組織中的積累機(jī)制。

為避免從頭轉(zhuǎn)錄組組裝的技術(shù)局限性，作者利用PacBio單分子實(shí)時(shí)（SMRT） 測(cè)序獲得了從 P. tetrastichus組織中分離的RNA的全長(zhǎng)互補(bǔ)DNA（cDNA）序列，從而生成參考轉(zhuǎn)錄組，然后對(duì)多個(gè)植物組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.轉(zhuǎn)錄組分析——哌啶基-酮化物中間體合成基因發(fā)現(xiàn)

植物中雜環(huán)亞胺的產(chǎn)生，例如石松生物堿的 1-哌啶前體，涉及 Lys/Orn 氨基酸的脫羧，然后是所得多胺的氧化，這兩者幾乎是植物中常見(jiàn)的代謝過(guò)程。賴(lài)氨酸脫羧酶 （LDC） 酶和銅胺氧化酶（CAO） 是該途徑早期步驟的基因，作者進(jìn)一步研究LDC和CAO基因的代謝機(jī)制。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，作者發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)LDC 同源基因（PtLDC-1和PtLDC-2）（圖 2C）和兩個(gè)CAO基因（PtCAO-1和PtCAO-2），并且發(fā)現(xiàn)PtCAO基因與 PtLDC基因具有強(qiáng)烈共表達(dá)，說(shuō)明它們參與了相同的代謝途徑，可能與石松生物堿的生物合成相關(guān)。

為了驗(yàn)證PtLDC和PtCAO基因的功能，在煙草葉片中單獨(dú)和共轉(zhuǎn)化。然后通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析葉提取物，以評(píng)估代謝物積累的變化。結(jié)果顯示，兩種 PtLDC 同源基因都顯著升高了尸胺水平（圖 3）。PtCAO同源基因與PtLDC同源基因的共表達(dá)導(dǎo)致生成的尸胺消耗和1-哌啶二聚體和三聚體的產(chǎn)生（圖3）。并且發(fā)現(xiàn)同源基因的功能是冗余的，因此在所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用PtLDC-2和PtCAO-1產(chǎn)生1-哌啶聚合物。

3.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析——石松生物堿生物合成中形成 4PAA 和 peletierine 關(guān)鍵酶基因發(fā)現(xiàn)

接下來(lái)，推測(cè)通過(guò)向 1-哌啶聚合物中添加丙二酰輔酶 A 衍生的聚酮鏈以產(chǎn)生 4-（2-哌啶基）乙酰乙酸（4PAA），該酸可以脫羧產(chǎn)生peletierine（圖 1B）。聚酮底物的產(chǎn)生表明聚酮合酶（PKS）酶參與催化這種亞胺-酮縮合反應(yīng)，并在石松生物堿的生物合成中起作用。進(jìn)一步分析揭示了兩個(gè)PKS候選基因（PtPIKS-1和PtPIKS-2），與PtLDC-1共表達(dá)基因之一（圖2C）。PtPIKS-1 PtPIKS-2與PtLDC-2 和PtCAO-1在煙草葉片中的瞬時(shí)共表達(dá)導(dǎo)致1-哌啶代謝物的消耗和幾種新化合物的產(chǎn)生。其中一種化合物具有與假定的石松生物堿前體peletierine相對(duì)應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù) （[M+H]=m/z
142.1226），并通過(guò)與合成標(biāo)準(zhǔn)品的比較來(lái)驗(yàn)證這一點(diǎn)（圖 3）。此外，作者觀察到與4PAA質(zhì)量數(shù)相同的化合物的產(chǎn)生（[M+H]=m/z 186.1125），其結(jié)構(gòu)分配由串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）碎裂支持（圖3）。作者認(rèn)為 4PAA（一種β酮酸）的自發(fā)脫羧會(huì)導(dǎo)致pelletierine的產(chǎn)生，煙草實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證這一點(diǎn)（圖 3）。綜上所述，PtPIKS-1和PtPIKS-2可能是石松生物堿生物合成中形成 4PAA 和peletierine的關(guān)鍵酶。

為了更好地了解這種亞胺-酮縮合的機(jī)制，獲得了兩種PtPIKS同源基因的純化蛋白用于體外分析。與我們?cè)诒臼綗煵葜械慕Y(jié)果一致，當(dāng)添加 1-哌啶和丙二酰輔酶 A 作為底物時(shí)，PtPIKS-1和PtPIKS-2在體外測(cè)定中都產(chǎn)生了4PAA和pelletierine（圖4 A和B），此外還有其他幾種未知化合物。雖然當(dāng)單獨(dú)孵育 1-哌啶作為底物時(shí)沒(méi)有觀察到明顯的產(chǎn)物，但僅向PtPIKS-1添加丙二酰輔酶 A 會(huì)導(dǎo)致 3-氧代戊二酸的積累（圖 4 C 和 D）。3-氧代戊二酸的積累表明，PIKS能夠催化兩個(gè)丙二酰輔酶A單元縮合成硫酯連接的3-氧代谷氨?；鶊F(tuán)，并且該聚酮酸從硫酯鍵上酶促或非酶水解。

4.代謝組學(xué)分析——石松生物堿生物合成中代謝物合成機(jī)制

研究報(bào)道指出，在石松屬和托烷生物堿生物合成中觀察到的亞胺-酮縮合是通過(guò) 3-氧代戊二酸與環(huán)亞胺共底物的非酶促脫羧縮合發(fā)生的。盡管這種非酶縮合是可能的，但作者想進(jìn)一步評(píng)估3-氧代戊二酸作為生物合成中間體的相關(guān)性。為此，比較了在含有PtPIKS-1的體外反應(yīng)中將3-氧代戊二酸或丙二酰輔酶A與1-哌啶配對(duì)時(shí) 4PAA/peletierine生產(chǎn)的反應(yīng)速率。雖然觀察到1-哌啶和3-氧代戊二酸在低水平下自發(fā)縮合，但當(dāng)丙二酰輔酶A作為與1-哌啶的共底物時(shí)，產(chǎn)物形成速率顯著增加（圖4E）。此外，在測(cè)量的底物濃度（2至200μM，圖4E），而丙二酰輔酶 A 和 1-哌啶之間的縮合顯然是酶依賴(lài)性的（圖4A和B）。因此，雖然1-哌啶和3-氧代戊二酸之間的自發(fā)縮合可以在低水平下發(fā)生，但這些數(shù)據(jù)支持一個(gè)model，其中PIKS催化的縮合發(fā)生在1-哌啶和源自丙二酰輔酶A的聚酮硫酯之間。為了支持這一結(jié)論，當(dāng)丙二酰輔酶A作為PtPIKS-1的底物在體外被納入時(shí)，可以檢測(cè)到累積的乙酰乙酰輔酶A（圖4F）。乙酰乙酰輔酶A的積累雖然是間接的，但表明會(huì)產(chǎn)生一種3-氧代戊二酰輔酶A代謝物，該代謝物會(huì)迅速發(fā)生脫羧。作者無(wú)法直接檢測(cè)3-氧代戊二酰輔酶A，并推測(cè)這是由于這種中間體的瞬時(shí)、不穩(wěn)定性質(zhì)所致。有趣的是，乙酰乙酰輔酶A與1-哌啶發(fā)生酶非依賴(lài)性縮合，產(chǎn)生peletierine。然而，這種縮合不會(huì)產(chǎn)生4PAA，因此其在石松生物堿生物合成中的相關(guān)性尚不清楚。

通過(guò)LC-MS分析無(wú)法檢測(cè)到與4PAA-CoA硫酯有關(guān)的代謝物。因此，作者考慮了將 3-氧代谷二酰基部分重新加載到PtPIKS催化的半胱氨酸上之后發(fā)生亞胺-酮縮合的可能性。為了研究是否存在與PtPIKS-1的催化半胱氨酸結(jié)合的任何?；虚g體，作者用羥胺處理體外酶促反應(yīng)，羥胺已被用于捕獲硫酯中間體作為相應(yīng)的異羥肟酸衍生物。當(dāng)丙二酰輔酶A和1-哌啶作為底物時(shí)，作者注意到與4PAA的異羥肟酸相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量的羥胺（[M+H]=m/z201.1234，圖4G）。這一觀察結(jié)果，以及無(wú)法檢測(cè)到 4PAA-CoA代謝物，表明存在瞬時(shí)酶結(jié)合的4PAA硫酯。

總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)支持了這種亞胺-酮縮合的暫定機(jī)制（圖4H）：

1） 將丙二酰輔酶A加載到PIKS的催化半胱氨酸上；

2）第二個(gè)丙二酰輔酶A與酶結(jié)合的丙二?；目巳R森縮合，從而形成3-氧代戊二酰輔酶A；

3）將3-氧代谷氨?；糠种匦录虞d到酶上；

4）酶結(jié)合的聚酮與1-哌啶的脫羧縮合，產(chǎn)生酶結(jié)合的4PAA；

5）硫酯水解生成4PAA，在溫和條件下可自發(fā)脫羧生成pelletierine。

雖然需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示該反應(yīng)的精確事件順序和機(jī)理細(xì)節(jié)，但這些數(shù)據(jù)證明了PIKS在催化石松生物堿生物合成中的亞胺-酮縮合中的關(guān)鍵作用。

5.代謝組學(xué)分析——HupB的后期氧化反應(yīng)

目前研究尚未證實(shí) HupA 生物合成中的任何下游中間體，但從各種苔蘚物種中分離生物堿可能與兩個(gè)含8碳哌啶的亞基摻入石松生物堿的生物合成相關(guān)（圖 1B）。但是詳細(xì)的代謝合成機(jī)制還不清楚。作者通過(guò)與4PAA/peletierine生物合成的 3 個(gè)高度共表達(dá)基因分析，作者發(fā)現(xiàn)了富集最顯著的一類(lèi)酶：Fe（II）/2-氧代戊二酸依賴(lài)性雙加氧酶（2OGDs）（圖2B，C）。作者將這些高度共表達(dá)的2OGD作為下游石松生物堿代謝途徑中的強(qiáng)候選基因。

與 HupA 天然共存的多種石松生物堿，包括石杉?jí)AB（HupB）和石杉?jí)AC （HupC），推測(cè)是其生產(chǎn)的邏輯途徑中間體，因此可能是潛在的前體（圖 1B）。盡管這些分子之前都沒(méi)有被驗(yàn)證為HupA前體，但在P. tetrastichus的新生長(zhǎng)組織中都可以檢測(cè)到HupB和HupC，支持了它們作為植物中潛在代謝中間體的結(jié)論。HupB的轉(zhuǎn)化需要C環(huán)哌啶部分的氧化裂解（圖1B）。因此，作者推測(cè)2OGD 以及細(xì)胞色素P450（CYP）和含黃素的單加氧酶（FMO）參與催化合成HupB。根據(jù)與PtLDC、PtCAO和PtPIKS基因的高共表達(dá)基因作為上述基因家族的候選基因，然后通過(guò)體外表達(dá)候選基因驗(yàn)證酶的活性功能。結(jié)果顯示，一種 2OGD酶（Pt2OGD-1） 消耗HupB并產(chǎn)生HupC，而第二個(gè)2OGD（Pt2OGD-2） 消耗HupC產(chǎn)生 HupA （圖5）。綜上所述，一對(duì)2OGD酶負(fù)責(zé)通過(guò)逐步氧化環(huán)裂解和中性雙鍵異構(gòu)化的氧化還原在石松生物堿生物合成中將HupB轉(zhuǎn)化為HupA。此外，之前的研究報(bào)道HupB 和HupC在生產(chǎn)HupA的植物中一直存在，但它們?cè)贖upA生物合成中的途徑尚未研究，因此作者的研究結(jié)果證明了它們?cè)谠撏緩街械闹虚g體作用。

6. 代謝組分析——HupA生物合成途徑下游基因的解析

為進(jìn)一步研究其他下游生物合成途徑。特別是，兩種石松生物堿，des-N-methyl-α-obscurine（DNMAO）和des-N-methyl-β-obscurine（DNMBO），與HupB共享相同的碳骨架，可能是HupB的前體（圖 5）。因此作者通過(guò)與上述已知基因的高共表達(dá)分析及體外酶活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)另一種獨(dú)特的2OGD酶（Pt2OGD-3）能將DNMAO轉(zhuǎn)化為DNMBO（圖5），從而形成最終在HupA中發(fā)現(xiàn)的吡啶酮環(huán)。并且發(fā)現(xiàn)Pt2OGD-1和Pt2OGD-2可以依次作用于DNMBO，以產(chǎn)生假定的HupC和HupA的8,15-二氫同系物。Pt2OGD-1不作用 DNMAO，表明在DNMBO和HupB中發(fā)現(xiàn)的吡啶酮環(huán)的存在對(duì)Pt2OGD-1底物結(jié)合和/或催化活性至關(guān)重要，但是參與其中的去飽和酶尚未被發(fā)現(xiàn)。

本研究中鑒定的所有三個(gè)2OGD均與已發(fā)現(xiàn)的PtLDC-1高度相關(guān)（圖2C）。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了共表達(dá)分析可以作為鑒定石松生物堿生物合成調(diào)節(jié)基因的方法，并且這些鑒定的基因很可能在同一代謝途徑中起作用?？傮w而言，通過(guò)聯(lián)合使用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，作者確定了石松生物堿代謝基因的緊密共表達(dá)模塊，從而使我們能夠在HupA的生物合成中發(fā)現(xiàn)幾種生物合成酶（圖6）。

研究總結(jié)

本研究揭示了新生長(zhǎng)組織中的特異性代謝物生物合成活性以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明石松生物堿生物合成的發(fā)育控制。植物生物堿的組織和細(xì)胞特異性，并且在新生長(zhǎng)組織中生物活性生物堿的產(chǎn)生可能增強(qiáng)了這些易感的新組織免受食草動(dòng)物的侵害方面的抗性作用。石松科物種的生長(zhǎng)緩慢和難以培養(yǎng)，因此通過(guò)解析石松生物堿合成途徑，有助于在體外進(jìn)行大規(guī)模代謝物生產(chǎn)?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)HupA生物合成的轉(zhuǎn)錄和生化基礎(chǔ)的深入了解為未來(lái)對(duì)石松生物堿以及植物產(chǎn)生的許多其他神經(jīng)活性脂肪族生物堿的研究提供了基礎(chǔ)性的理解。