英文名:?Integrated transcriptome, proteome and?physiology analysis of Epinephelus coioides after?exposure to copper nanoparticles or copper?sulfate
雜志：Nanotoxicology，2017
影響因子：6.248
研究背景
近年來，納米銅粒子(cu-nps)在日常消費(fèi)品以及電子、醫(yī)療、生物科學(xué)等行業(yè)中的應(yīng)用隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展而不斷增加。盡管預(yù)計(jì)納米技術(shù)產(chǎn)品的范圍擴(kuò)大將帶來明顯的好處，但對(duì)其在海洋環(huán)境中的影響及其與水生生物群的可能相互作用的了解并不多。銅納米粒子可在水生生物中積累，并轉(zhuǎn)移到更高的營(yíng)養(yǎng)水平，對(duì)動(dòng)物和人類健康構(gòu)成危害。常規(guī)生物標(biāo)志物（例如抗氧化酶，脂質(zhì)過氧化，金屬硫蛋白，DNA損傷）被證明是敏感的評(píng)估Cu-NPs毒性作用的指標(biāo)。盡管如此，可能有更多的特定基因和蛋白質(zhì)可有效評(píng)估納米顆粒特異性生物反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于納米毒理學(xué)可能有助于了解不同類型Cu污染物在水生生物中的主要毒性機(jī)制和作用模式，并幫助確定納米顆粒暴露和影響的新穎和無偏見的生物標(biāo)志物。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組可能提供了一個(gè)洞察分子機(jī)制潛在Cu誘導(dǎo)魚類反應(yīng)，并且可能是一種有效的方法識(shí)別新蛋白質(zhì)以及評(píng)估生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。
Epinephelus coioides（橙斑石斑魚），一種原生型雌雄同體的海洋魚類，在中國(guó)廣泛流行，因?yàn)槠鋬?yōu)良的肉質(zhì)使其具有很高的商業(yè)價(jià)值。目前，E. coioides主要在漂浮網(wǎng)箱養(yǎng)殖，在自然環(huán)境中很容易就可以受環(huán)境污染影響。本研究結(jié)合生理分析，轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析研究納米銅或硫酸銅暴露下石斑魚體內(nèi)蛋白及基因的差異變化。
材料和方法
取樣部位為魚肝臟，主要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白組學(xué)（iTRAQ）及生理實(shí)驗(yàn)
- 粒子表征分析
將納米顆粒分散在超純水，制備出含1.0 g Cu-1的銅離子溶液。用透射電鏡(tem，jeol jem-2100，日本東京)和納米粒子追蹤分析(nta，Nanosight lm 10)對(duì)其粒徑進(jìn)行表征研究。
- 實(shí)驗(yàn)處理及死亡率評(píng)估：
石斑魚被暴露在不同濃度(1.6，1.6，2.4，3.7，5.8或9.0毫克的cu l 1)的cu-np中。這些濃度是根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)選擇確定。在暴露期間，魚不被喂食，死魚被移除。急性暴露時(shí)間持續(xù)24小時(shí)，并在結(jié)束時(shí)評(píng)估魚的死亡率。
- 取樣：
用1毫升肝素化注射器從尾靜脈抽取血液進(jìn)行生化分析，取出肝臟，用生理鹽水(鹽度8.6‰w/v，4c)清洗和沖洗脂肪，然后立即將肝臟冷凍在液氮中進(jìn)行后續(xù)分析（蛋白組和轉(zhuǎn)錄組分析）。為便于組織學(xué)觀察，分別從每個(gè)復(fù)制的剩余魚中提取肝臟(左葉)樣本，并在10%v/v緩沖液中固定。
- 脂肪含量和脂肪酸組成分析通過GC/MS進(jìn)行檢測(cè)。
研究結(jié)果
1、Cu-NPS的特性
Cu-NPS呈顆粒狀，呈團(tuán)聚狀，海水中的平均粒徑(205±83 nm)大于實(shí)驗(yàn)主要的粒徑(95±30 nm)。（見下表）
24小時(shí)后，Cu-NPs在海水中釋放后可溶性Cu為0.02毫克Cu L 1（Cu的初始質(zhì)量的0.83％），（補(bǔ)充材料，圖S1）。X射線衍射表明Cu在海水中24小時(shí)后被氧化。
2、存活率和組織學(xué)觀察
暴露于cu-nps或硫酸銅可導(dǎo)致石斑魚存活率呈濃度依賴性下降。cu-nps處理下LC 50值為4.8 mg cu l -1，硫酸銅為5.8 mg cu l -1?(圖1(A))。在cu-nps濃度為2.4 mg cu l -1下使死亡率達(dá)到20%，驗(yàn)證了圖1(A)所建立的模型。
組織學(xué)觀察顯示正常肝竇和血管系統(tǒng)正常，而Cu-NPS或硫酸銅處理的魚肝則顯示靜脈內(nèi)有血細(xì)胞沉積和竇擴(kuò)張，竇變不規(guī)則(圖1(B))，Cu-NPS組的肝損傷大于CUO 4組。
3、差異比較分析
分別與對(duì)照組比較后，在cu-nps和硫酸銅處理鑒定出差異表達(dá)的基因/蛋白。在cu-nps和cu-nps處理中，分別鑒定出1428和2239個(gè)表達(dá)差異顯著的基因，其中911個(gè)基因在這兩個(gè)處理中都很常見(圖2(A))，總共有354和140個(gè)顯著變化的蛋白質(zhì)，其中75種蛋白質(zhì)共同存在于這兩種處理中(圖2(B))。
4、基因和蛋白基于GO的功能分析
對(duì)差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行了分類。共有11417個(gè)轉(zhuǎn)錄本和3210種蛋白質(zhì)被分為三大類：生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能(圖3)。28788個(gè)GO被注釋到11417個(gè)映射的轉(zhuǎn)錄本，10506個(gè)GO注釋到3210個(gè)蛋白質(zhì)中。參與“細(xì)胞過程”和“代謝過程”的基因和蛋白質(zhì)是生物學(xué)過程中較大的兩類，分別占轉(zhuǎn)錄本的20.4%和15.0%，以及14.8%和13.4%的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞成分類別中，基因和蛋白質(zhì)涉及“細(xì)胞”(27.8%份轉(zhuǎn)錄本和20.7%份蛋白質(zhì))、“細(xì)胞部分”(27.8%份轉(zhuǎn)錄本和20.7%份蛋白質(zhì))和“細(xì)胞器”(19.2%份轉(zhuǎn)錄本)。在分子功能類別中，“結(jié)合”占49.6%個(gè)基因和46.2%個(gè)蛋白質(zhì)，30.2%個(gè)轉(zhuǎn)錄本和36.1%個(gè)蛋白質(zhì)具有“催化活性”(圖3(C))。
5、COG功能分類
3294個(gè)蛋白及11619轉(zhuǎn)錄本被功能注釋到(圖4)。這些轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)分別分布在25和24個(gè)COG類別中，其中“僅一般功能預(yù)測(cè)”是轉(zhuǎn)錄本的較大組(總共1732個(gè))和蛋白質(zhì)(630)，之后是“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”，“翻譯后修飾、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)、伴侶”、“功能未知”、“轉(zhuǎn)錄”、“細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)”、“細(xì)胞骨架”和“RNA加工和修飾”。在“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”這類中轉(zhuǎn)錄本3.2%（總共372個(gè)）和蛋白質(zhì)4.6%（153）
6、RNA與蛋白質(zhì)表達(dá)的相關(guān)性分析
用蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法獲得的差異表達(dá)蛋白與mRNA進(jìn)行了比較分析；根據(jù)他們的氨基酸序列來匹配轉(zhuǎn)錄本，在Cu-NPs組與對(duì)照組及CuSO4和對(duì)照組相比較，分別共140（100%）和352（99.4%）個(gè)差異表達(dá)的蛋白。我們進(jìn)一步確定在兩種銅粒子下蛋白和基因的表達(dá)是否一致，發(fā)現(xiàn)21的轉(zhuǎn)錄和蛋白在同一方向改變（13個(gè)上調(diào)，八個(gè)下調(diào)）（表2）。有趣的是，大多數(shù)基因（16個(gè)基因）的表達(dá)在Cu-NPS比CuSO4更強(qiáng)烈，但是蛋白質(zhì)卻相反。
7、肝臟脂質(zhì)含量和脂肪酸組成
與對(duì)照組相比，在兩種銅形式下，肝臟中脂類、甘油三酯和膽固醇含量均顯著降低，但兩種銅形式下相比無顯著性差異(P>0.05)。正常脂質(zhì)積累(紅色染色表明的脂滴)在對(duì)照組中明顯增加，而Cu-NPS或硫酸銅暴露則減少了脂滴的數(shù)量(圖5(D))，任何一種銅暴露均降低了總多不飽和脂肪酸，但總單不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸(Psfa)較對(duì)照組增加，而在Cu-NPS中，多不飽和脂肪酸(圖5(E))的作用更為明顯(圖5(E))。與對(duì)照相比，cu-nps或硫酸銅暴露后，脂肪酸、二十碳五烯酸(epa，c20：5)、二十二碳六烯酸(dha，c22：6)和二十二碳五烯酸(dpa，c22：5)均下降，而cu-nps中脂肪酸組分的含量比cu-nps明顯增加(圖5(F))。
文章亮點(diǎn)
- 石斑魚是一種具有較大經(jīng)濟(jì)效益的魚類本文研究其對(duì)兩種銅形式下的毒害機(jī)理有著非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
- 表型數(shù)據(jù)豐富，文章分別從不同銅形式下的粒子表型特征，到不同銅濃度下魚死亡率，脂類物質(zhì)的測(cè)定，銅濃度的選擇進(jìn)行研究及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有理有據(jù)，層次清晰。
- 文章亮點(diǎn)在結(jié)合轉(zhuǎn)錄組及蛋白組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析緊密與毒害的表型數(shù)據(jù)相結(jié)合，從DEGs的COG和KEGG注釋和富集分析的結(jié)果來解析毒害的分子機(jī)制。
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