綜合方法揭示了三種東方煙草品種中突出代謝多樣性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本和代謝物

英文名稱(chēng): Comprehensive approaches reveal key transcripts and metabolites highlighting metabolic diversity among three oriental tobacco varieties

中文名稱(chēng): 綜合方法揭示了三種東方煙草品種中突出代謝多樣性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本和代謝物

雜志：Industrial Crops & Products 2020

影響因子： 4.244

研究背景

煙草(Nicotiana tabacum L.)是一種商業(yè)上重要的農(nóng)作物，在 12 個(gè)歐洲聯(lián)盟(歐盟)國(guó)家種植面積約 10 萬(wàn)公頃，每年生產(chǎn) 20 萬(wàn)噸干葉(歐洲聯(lián)盟委員會(huì)，2015 年)。希臘是歐洲第二大煙草生產(chǎn)的國(guó)家。在希臘栽培的煙草品種主要是東方煙（曬干）品種，主要特點(diǎn)是小的植株和葉片大小以及其獨(dú)特的芳香性?！癤anthi 81”, “Katerini 53”和“Smirni 3B”這三個(gè)品種的特點(diǎn)是它們的性質(zhì)不同，特別是它們的香氣和風(fēng)味。對(duì)這三個(gè)品種的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的整合提供了對(duì)可能影響重要煙草特征的遺傳背景的深入了解，并顯示了操縱這些途徑用于育種或生物技術(shù)目的的潛力。

材料方法

1、 實(shí)驗(yàn)材料：“Xanthi 81”, “Katerini 53” 和 “Smirni 3B”

2、 研究方法：轉(zhuǎn)錄組；代謝組。

研究結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)錄組分析

1.1“ Xanthi 81”和“ Katerini 53”中的差異表達(dá)（FPKM> 1）

基因在“ Xanthi 81”和“ Katerini 53”之間表達(dá)差異較大的基因?yàn)镹itab4.5_0000194g0060，該基因在“ Katerini 53”中的表達(dá)比“ Xanthi 81”高13.4 倍。與“Xanthi 81”相比，該基因在“ Katerini 53”中上調(diào)的事實(shí)表明，該品種可能具有多種反應(yīng)機(jī)制。在兩個(gè)品種之間差異表達(dá)的另一個(gè)煙草基因 Ni?tab4.5_0000194g0070，推測(cè)其可能編碼另一個(gè) T-葉綠素蛋白，但轉(zhuǎn)錄本似乎帶有終止密碼子，并且與 T-葉綠素 2b 不同（GenBank：BAJ25790.1）。兩個(gè)品種之間的第三大差異基因是編碼脂肪氧化酶的基因 Ni?tab4.5_0002164g0020。與編碼細(xì)胞溶解酶受體激酶 5（LYK5）的“ Xanthi 81”相比，“ Katerini 53”中的 Ni-tab4.5_0000525g0010 也顯著上調(diào)。最后一個(gè)基因是 Nitab4.5_0000363g0260；BLAST 結(jié)果表明被翻譯成 CP12-1 蛋白參與Calvin-Benson 循環(huán)。在煙草中，反義抑制 CP12 的表達(dá)對(duì)光合作用本身沒(méi)有很大影響。但是，反義表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草的表型顯示出異常的葉片形態(tài)，生長(zhǎng)，矮化和頂端優(yōu)勢(shì)減少。對(duì)這些煙草進(jìn)行的進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)發(fā)生了輕微變化，但某些初級(jí)代謝酶，對(duì)脅迫做出響應(yīng)的基因以及參與多胺代謝的基因發(fā)生了顯著變化，所有這些都表明 CP12 蛋白的作用更為復(fù)雜。

1.2. “ Xanthi 81”和“ Smirni 3B”中的差異表達(dá)（FPKM> 1）基因

與“ Xanthi 81”相比，“ Smirni 3B”和“ Katerini 53”中存在三種常見(jiàn)的過(guò)表達(dá)基因。除了 Nitab4.5_0001847g0020.1，另外兩個(gè)分別為編碼 LOX 2.1 和 CP12-1 蛋白質(zhì)的 Nitab4.5_0002164g0020.1 和 Nitab4.5_0000363g0260.1。煙草的CP12-1 同源物在兩者之間表達(dá)最多，在“Smirni3B”和“Katerini53”兩個(gè)品種中的表達(dá)值相同（199.9 vs 198），這表明 CP12 在“Xanthi 81”中低水平表達(dá)。目前煙草品種之間 CP12 的表達(dá)差異可能反映了生產(chǎn)力，植物防御力或任何其它尚未確定的途徑的差異，這些來(lái)可能對(duì)煙草育種產(chǎn)生巨大影響。

在 “Xanthi 81” 和 “Smirrni 3B” 之間差異表達(dá)大的一個(gè)基因是Nitab4.5_0000200g0190.1。推測(cè)參與 HGL-DTGs 生物合成相關(guān)。HGL-DTG 是非常重要的二萜，在幾種茄科物種中大量產(chǎn)生。與被抑制（FPKM = 13.6）的“ Xanthi 81”相比，該基因主要在“ Katerini 53”（FPKM = 80）和“ Smirrni 3B”（FPKM = 76.1）兩個(gè)品種中高表達(dá)。同時(shí)，在“ Katerini 53”和“ Smirrni 3B”中也顯著誘導(dǎo)了產(chǎn)生香葉基香葉基二磷酸（焦磷酸）（GGPP）的基因的同系物，GGPP是 HGL-DTG 生物合成的前體。共檢測(cè)到了三種 GGPP 合成酶。GGPPS1 主要在“ Katerini 53”（FPKM = 82.9）和“ Smirrni 3B”（FPKM = 89.3）表達(dá)，而在“ Xanthi 81”（FPKM = 40.6）中較低的表達(dá)。第二個(gè)幾乎在所有三個(gè)品種中平均表達(dá)，而第三個(gè)幾乎不表達(dá)。品種之間的這種差異可表明萜類(lèi)化合物的產(chǎn)量存在差異。然而，在這項(xiàng)研究中，作者沒(méi)有關(guān)注生產(chǎn)的萜類(lèi)。

2.GO 富集分析

對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行 GO 富集分析。在生物過(guò)程類(lèi)別中，主要與超氧化物酶代謝，精氨酸分解代謝，蘋(píng)果酸代謝和多胺生物合成有關(guān)。分子功能類(lèi)別中的富集類(lèi)別為硫氧還蛋白活性，固醇結(jié)合，L-蘇氨酸氨裂解酶活性和富馬酰乙酰乙酸酶活性。在細(xì)胞成分類(lèi)別中，主要為高爾基體堆積，小亞基加工體，細(xì)胞外間隙和 1,3-β-D-葡聚糖合酶復(fù)合體。

3．苯丙素生物合成

在大多數(shù)植物中，苯丙烷的生物合成從 L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸酯（或肉桂酸）開(kāi)始，并形成多種多酚。其中有四分之二的在所有品種的葉片中均高表達(dá)，剩余的則表達(dá)較少。PAL1（Ni-tab4.5_0000754g0260.1）在所有品種中表達(dá)最高，其次是 PAL4（Nitab4.5_0000101g0270.1）。與其它兩個(gè)品種的葉子相比，在“ Katerini 53”中兩個(gè) PAL 基因都檢測(cè)到高表達(dá)。而在結(jié)果中僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)低豐度肉桂酸基因（C4H），而該基因在“Katerini 53”中仍被上調(diào)。另一方面，有多個(gè) CoA-連接酶（4CL）基因，除了其中兩個(gè)外，大多數(shù)基因低表達(dá)。Ni-tab4.5_0002394g0060.1 和 Nitab4.5_0001842g0060.1 在“Xanthi 81”葉片中均上調(diào)。這兩個(gè)基因可能是兩個(gè)不同的等位基因，因?yàn)樗鼈兣c同一基因具有高度同源性（NCBI 基因 ID：107783543，草酸-CoA 連接酶類(lèi)似）。這些基因有助于將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為 4-香豆基輔酶 A，這是一種重要的中間體，可作為下游許多產(chǎn)物合成的前體。HCT/HQT 和 C3H 這兩個(gè)基因參與了 CGA 的合成。在結(jié)果中后者幾乎沒(méi)有表達(dá)。但檢測(cè)到 3 個(gè)高表達(dá)的 HCT/HQT。其中兩個(gè)（Ni?tab4.5_0002724g0070.1 和 Nitab4.5_0002320g0020.1）是煙草 hqt 基因的不同等位基因（NCBI：NP_001312079）。兩者在“Xanthi 83”中均被上調(diào)。HQT優(yōu)選結(jié)合奎寧酸酯而不是草莽酸以產(chǎn)生 CGA。本氏煙草中 HQT 基因的過(guò)表達(dá)顯著提高了 CGA 的產(chǎn)量。第三個(gè)為 Nitab4.5_0001271g0010.1 是從煙草莖中純化的 HCT 基因（NCBI：NP_001312552），被發(fā)現(xiàn)可催化 CGA 和木質(zhì)素的合成，但是，該基因表達(dá)不足，品種間沒(méi)有明顯差異。

3.1．黃酮醇

查爾酮合酶（CHS）是類(lèi)黃酮生物合成中的關(guān)鍵酶。研究者發(fā)現(xiàn)兩個(gè) CHS基因在三個(gè)煙草品種的葉片中均低表達(dá)，因?yàn)?CHS 主要在花中組成性表達(dá)，但其表達(dá)主要是由非生物/生物脅迫誘導(dǎo)的。注釋為 CHS-1B 或 CHS2 的Nitab4.5_0002920g0060.1 在’Katerini 53’和’Xanthi 81’中略有上調(diào)，但第二個(gè)注釋為 III 型聚酮化合物合酶（NCBI：XP_016446648.1）差異很小。所有 CHI 基因也僅以低水平表達(dá)，在鑒定的結(jié)果中 F3H 也沒(méi)有差異。另一方面，鑒定了兩個(gè)參與黃酮醇形成的 FLS 基因。FLS1（Nitab4.5_0005357g0020.1）（NCBI：LOC107794305）的表達(dá)最高，而 NtFLS（Ni-tab4.5_0006276g0010.1）的表達(dá)低得多。這兩個(gè)基因在品種之間沒(méi)有差異表達(dá)。還檢測(cè)到有助于花色苷生物合成的基因，例如 DFR 和 ANS。DFR 中第一個(gè)僅適度表達(dá)，另外一個(gè)沒(méi)有差異。ANS（Nitab4.5_0003274g0110.1）幾乎未表達(dá)（圖 2）。蘆丁是一種黃酮醇糖苷，在花青素途徑生物合成，其中包括黃酮醇 3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和黃酮醇 3-O-葡萄糖苷胰島素轉(zhuǎn)移酶。結(jié)果表明低表達(dá)的 4 種黃酮醇 3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶和 2種黃酮醇 3-O-糖苷胰島素轉(zhuǎn)移酶在“Smirrni 3B”和“Xanthi 81”比“Katerini 53”中表達(dá)更高、更多。

研究結(jié)果表明，在兩個(gè) PAL 基因的表達(dá)中檢測(cè)到品種之間的顯株差異。與其它兩個(gè)基因相比，“Xanthi 81”中的基因表達(dá)不足，這可能意味著該品種中向CGA 的苯基-丙烷途徑的產(chǎn)物通量不同，因?yàn)楫?dāng)煙草中 PAL 過(guò)度表達(dá)時(shí)，PAL 活性及其含量顯著更高，其后的 CGA 濃度比蘆丁更高，這意味著更多的產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移至該選擇性途徑。具有顯著較高的 CGA 含量的煙草植物中 PAL 含量的升高也與真菌感染的易感性降低有關(guān)。

4．代謝組分析

采集“Katerini 53”，“Xanthi 81”和“Smirrni 3B”葉片樣品，并使用氣相色譜GC-MS 和 LC-MS / MS 方法進(jìn)行代謝分析?；蛐皖A(yù)先鑒定為不同的色譜模式，共有 78 種代謝化合物（包括糖，氨基酸，有機(jī)酸）差異積累，如圖 3 所示。詳細(xì)的非靶向 GC-MS 代謝組學(xué)分析用于鑒定煙葉中產(chǎn)生的大多數(shù)主要代謝產(chǎn)物。在本研究中，所測(cè)得的最豐富的可溶性糖是果糖，葡萄糖，半乳糖和蔗糖。在果糖和蔗糖中檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；“Katerini 53”中的果糖含量更高，而“Smierni 3B”中的蔗糖含量更高?！癒aterini 53”與其它兩個(gè)品種相比葡萄糖和半乳糖水平較高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在可溶性醇中，兩個(gè)豐富的代謝產(chǎn)物是山梨糖醇和肌醇，但在品種之間未檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。這三個(gè)品種中的蘋(píng)果酸含量沒(méi)有任何統(tǒng)計(jì)上顯著不同?！癤anthi 81”葉子的氨基酸含量最高，但谷氨酸和 γ-氨基丁酸（GABA）除外。GABA 和脯氨酸是煙葉中的主要氨基酸。與其他兩個(gè)品種相比，“Smirrni 3B”中的 GABA 水平明顯更高。’Smirrni 3B’和’Xanthi 81’中的脯氨酸水平較高，而“Katerini 53”的脯氨酸水平最低。在“Smirrni 3B”中檢測(cè)到了高濃度的甘氨酸和絲氨酸這兩種必需氨基酸。煙草生物堿在根部合成，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片。生物堿、尼古丁與植物抗草食動(dòng)物防御有關(guān)。在三個(gè)品種中檢測(cè)到的尼古丁濃度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。結(jié)果表明，“Xanthi 81”的尼古丁濃度最高，而“Smirrni 3B”的尼古丁濃度最低。與“Katerini 53”相比，“Xanthi 81”中腐胺的含量有所降低，但其濃度仍高于“Smirrni 3B”。鑒定了所有擬參與煙草中尼古丁生物合成的相應(yīng)基因，但僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾個(gè)在成熟葉片中表達(dá)。然而，基因 XS 和 QPT（三分之二）在“Xanthi 81”中表達(dá)較高。與其它兩個(gè)品種相比，這與“Xanthi 81”葉片中較高的尼古丁含量相關(guān)，這表明它可能是遺傳控制的。

總體而言，煙草多酚在這三個(gè)品種中差異很大。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明在三個(gè)品種之間多酚成分的含量存在顯著差異。“Katerini 53”的 CGA，5-CGA 和 4-CGA 含量顯著更高，盡管對(duì)于后者的化合物，僅與“Smirni 3B”相比，差異才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

如上所述，“Xanthi 81”中兩個(gè) HCT/HQT 基因高表達(dá)，但與“Katerini 53”相比，其葉片中的 CGA 濃度較低。另一方面，HCT/HQT 基因的高表達(dá)可能由于前體的限制而導(dǎo)致更多的產(chǎn)物形成?！癤anthi 81”和“Smirrni 3B”中的香豆素衍生物，瑞香堿和莨菪堿等被下調(diào)。兩類(lèi)主要的類(lèi)黃酮，即黃酮和類(lèi)黃酮，起著保護(hù)細(xì)胞免受 UVeB 輻射的作用，因?yàn)樗鼈兙奂谌~片的表皮層中，并在 UVeB 區(qū)域強(qiáng)烈吸收光。NAR 是一種黃烷酮，是所有下游類(lèi)黃酮類(lèi)（包括黃酮醇）的前體?！癝mirni 3B”中 NAR 比“Xanthi 81”高出四倍。香草醛，一種低分子量的酚類(lèi)化合物，具有抗氧化和抗微生物特性。在“Smirni 3B”中發(fā)現(xiàn)了高含量的香草酸和香草醛，分別比其它品種含量高 3.5 倍和 4.26 倍。先前的研究表明，HCHL 基因的轉(zhuǎn)基因煙草品系顯示 CGA 和蘆丁的消耗高達(dá) 93％和 82％，而以前無(wú)法檢測(cè)到的香草酸和香草醇的含量卻上升了。與這些結(jié)果相吻合的是，“Smirni 3B”中的香草醛和香草酸含量高，而 CGA，東莨菪素和蘆丁含量低。此外，“Smirni 3B”的咖啡酸含量比“Katerini 53”高 3 倍，并且含量也高于“Xanthi 81”，這些差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！癤anthi 81”中的蘆丁濃度較高，但僅與’Smirni 3B’相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在‘Katerini53’葉提取物中，主要的香豆素-東莨菪堿積累量較大。在三個(gè)品種中似乎僅黃素醇-3-O-葡糖苷胰島素轉(zhuǎn)移酶差異表達(dá)，這可能與僅在“Xanthi 81”和“Smirni 3B”中蘆丁各自濃度的差異有關(guān)。煙堿在“Xanthi 81”中檢出的濃度較高，但與其他兩個(gè)品種沒(méi)有顯著差異。