視網(wǎng)膜基因研究：Hi-C技術(shù)繪制高分辨率人類視網(wǎng)膜3D基因組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖譜

在過(guò)去視網(wǎng)膜疾病的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的變異主要在基因組非編碼區(qū)域，但由于先導(dǎo)變異區(qū)域的局部連鎖不平衡（LD），阻礙了特定關(guān)聯(lián)基因和變異的識(shí)別，因此闡明與性狀相關(guān)的遺傳變異如何影響調(diào)節(jié)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并因此影響表型，亟需了解相關(guān)組織和細(xì)胞類型的3D基因組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

近日，來(lái)自美國(guó)NIH國(guó)家眼科研究所Anand Swaroop團(tuán)隊(duì)通過(guò)Hi-C技術(shù)繪制了人類視網(wǎng)膜細(xì)胞染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖譜，揭示了人類視網(wǎng)膜中超級(jí)增強(qiáng)子（SEs）的3D染色質(zhì)組織的特性，并將得到的視網(wǎng)膜基因組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與通過(guò)GWAS識(shí)別的老年性黃斑變性（AMD）和青光眼相關(guān)的數(shù)量性狀基因座（quantitativetraitloci, QTL）和遺傳變異相結(jié)合，揭示了順式調(diào)控元件(CREs)的靶標(biāo)，表明了人類視網(wǎng)膜中SEs的3D染色質(zhì)組織的特性。此次人類視網(wǎng)膜高分辨率基因組結(jié)構(gòu)的研究為組織特異性功能的遺傳調(diào)控提供了新見(jiàn)解，并能夠解剖常見(jiàn)的致盲疾病表型。

研究背景

在不同組織和細(xì)胞類型中人類基因組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用建立了獨(dú)特的時(shí)空基因表達(dá)模式。非編碼遺傳變異可以通過(guò)染色質(zhì)空間構(gòu)象從而調(diào)控基因表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞表型。為了闡明人類視網(wǎng)膜的基因組調(diào)控，利用Hi-C技術(shù)以高分辨率揭示染色質(zhì)并與超級(jí)增強(qiáng)子（SE）、組蛋白標(biāo)記、CTCF結(jié)合和選擇轉(zhuǎn)錄因子相互作用，表明與邊緣SE的TAD相比，具有中心SE的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）表現(xiàn)出更強(qiáng)的絕緣性，并與視網(wǎng)膜基因的接觸增強(qiáng)。全基因組表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)（eQTL）分析與拓?fù)鋱D相結(jié)合，揭示了100個(gè)eQTL和與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性相關(guān)的相應(yīng)eGene之間的聯(lián)系，并發(fā)現(xiàn)了與年齡相關(guān)的黃斑變性和青光眼相關(guān)的易感變異的候選基因。對(duì)人類視網(wǎng)膜高分辨率基因組結(jié)構(gòu)的研究為組織特異性功能的遺傳控制提供了見(jiàn)解，提出了缺失遺傳性的模式，Hi-C組學(xué)技術(shù)為識(shí)別視網(wǎng)膜相關(guān)疾病表型提供有利工具。

研究設(shè)計(jì)

材料：一共取材5名患者捐贈(zèng)視網(wǎng)膜組織（2名女性，3名男性，年齡65-77歲）;Hi-C互作取3名男性和1名女性視網(wǎng)膜組織以及HCT116細(xì)胞系；CUT&RUN取1名75歲的女性外周視網(wǎng)膜組織；ATAC-seq取2名女性和3名男性視網(wǎng)膜組織。

方法：Hi-C互作(5kb)、ATAC-seq、Cut&Run、ChIP-seq（數(shù)據(jù)集：GSE13731134）、RNA-seq（數(shù)據(jù)集）

文章亮點(diǎn)

1）本文整合表觀調(diào)控全面的技術(shù)，利用Hi-C互作、ATAC-seq、Cut&Run、ChIP-seq等多組學(xué)不僅重構(gòu)了視網(wǎng)膜基因組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，還深入剖析了三維結(jié)構(gòu)對(duì)基因調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)；

2）視網(wǎng)膜調(diào)控基因組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與AMD和青光眼相關(guān)遺傳變異的首次詳細(xì)整合；

3）高分辨率的基因組結(jié)構(gòu)圖像(5kb)，深入研究常染色質(zhì)A/異染色質(zhì)B區(qū)域、TAD邊界、Loop形成的變化；

4）利用GWAS、eQTL等疾病性狀關(guān)聯(lián)分析建立與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性相關(guān)的相應(yīng)eGene之間的聯(lián)系。

主要研究?jī)?nèi)容

1、Hi-C測(cè)序以5kb高分辨率識(shí)別人類視網(wǎng)膜中的染色質(zhì)空間構(gòu)象

利用Hi-C技術(shù)檢測(cè)了4名眼科相關(guān)疾病患者的視網(wǎng)膜組織，以超高的分辨率（5kb）的重新繪制了人類視網(wǎng)膜細(xì)胞染色質(zhì)的組織（每個(gè)視網(wǎng)膜樣本的測(cè)序深度約為3億對(duì)reads，HCT116的深度約為5000萬(wàn)對(duì)read）。分析表明Hi-C數(shù)據(jù)在樣本間表現(xiàn)出高度的相似性，所有常染色體的分層相關(guān)系數(shù)(SCC)>0.97。整合所有樣本的數(shù)據(jù)一共獲得了11.48億對(duì)reads,其中有效互作reads的比例高達(dá)95%，不同染色體之間的互作trans占23.6%。

此次研究總共獲得了7.04億個(gè)有效染色質(zhì)互作，這些染色質(zhì)互作平均分布在染色體之間和染色體之內(nèi)。

本文Hi-C以3 kb的高分辨率識(shí)別出67,841個(gè)顯著的染色質(zhì)互作和2948個(gè)拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TADs）、以及60000多個(gè)loops的形成。如預(yù)測(cè)一樣，視網(wǎng)膜中活躍表達(dá)的基因在A Component染色質(zhì)區(qū)域，而大多數(shù)低活性的基因出現(xiàn)在B Component中，檢測(cè)全基因組loop環(huán)結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)，在A-A互作、A-B互作、B-B互作形成loops三種模式中，A-A互作形成loops距離小于B-B互作和A-B互作形成的loops，并且A-A形成的loops都是活躍的染色質(zhì)區(qū)域，跨度平均小于1Mb，大多數(shù)都是發(fā)生在TAD內(nèi)。

2、人視網(wǎng)膜染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有組織特異性和物種保守性

為了評(píng)估已識(shí)別的染色質(zhì)特征在人視網(wǎng)膜組織特異性和物種保守性，這里比較了人類神經(jīng)元（ACC）、GM12878淋巴細(xì)胞（LCL）、結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116，clone cancer）Hi-C測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜特異性基因，如OTX2、EYS、PDC，只存在于視網(wǎng)膜的A component；由于視網(wǎng)膜和ACC神經(jīng)元之間的高度相關(guān)性，比較發(fā)現(xiàn)PAX6基因座在神經(jīng)元和視網(wǎng)膜中的相互作用與其在兩個(gè)組織中的表達(dá)相似，而編碼OTX2和CRX兩個(gè)關(guān)鍵的視網(wǎng)膜TF，在視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出大量的局部相互作用，但在神經(jīng)元中沒(méi)有，表明人視網(wǎng)膜組織拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域具有組織特異性，并在基因調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。

小鼠和人類染色質(zhì)組織之間的相似性表明了跨物種的守恒，強(qiáng)調(diào)了染色質(zhì)組織模式與視網(wǎng)膜基因調(diào)控的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)小鼠TAD中21.8%的小鼠基因?qū)σ参挥谙鄳?yīng)的人類TAD中，超過(guò)三分之一（35.7%）的基因?qū)υ谛∈篌w內(nèi)通過(guò)染色質(zhì)環(huán)相互作用，在人類視網(wǎng)膜中也是如此。

在這兩個(gè)物種中，EGF和ENPEP之間都觀察到loops的形成，這些發(fā)現(xiàn)表明，視網(wǎng)膜表達(dá)的基因表現(xiàn)出保守的染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，突顯了其對(duì)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜基因的重要性，并可能涉及組織特異性順式調(diào)控元件CREs。

3、視網(wǎng)膜中SE與高度表達(dá)的組織特異性基因重疊，并富集視網(wǎng)膜TF結(jié)合motfis

染色質(zhì)互作形成的loops促進(jìn)CRE與其目標(biāo)基因之間的物理相互作用，并且在控制基因表達(dá)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了識(shí)別視網(wǎng)膜CRE，利用染色質(zhì)可及性檢測(cè)（ATAC-seq）確定了染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)和CUT&Run檢測(cè)活性（H3K4me3，H3K27Ac，H3K4me234）和抑制性（H3K9me3）組蛋白標(biāo)記互作的特征序列。通過(guò)全基因組染色質(zhì)開(kāi)放程度以及開(kāi)放區(qū)域（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、異染色質(zhì)、低豐度信號(hào)）構(gòu)建了10種染色質(zhì)狀態(tài)模型，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域富集了用于結(jié)合CTCF和關(guān)鍵視網(wǎng)膜TF，如CRX、NRL、OTX2、MEF2D、CREB和RORB，另外增強(qiáng)子主要在TSS上游區(qū)域富集，而啟動(dòng)子僅在TSS富集。

利用H3K27Ac蛋白標(biāo)記互作在視網(wǎng)膜順式調(diào)控元件啟動(dòng)子和活性或穩(wěn)定增強(qiáng)子區(qū)域鑒定了1325個(gè)超級(jí)增強(qiáng)子（SEs），發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜表達(dá)基因的數(shù)量與每個(gè)染色體的SE數(shù)量之間存在高度相關(guān)性。SE與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)集結(jié)合分析表明，與CRE相比，SE重疊的基因的平均表達(dá)量高2.17倍，并且比100組隨機(jī)SE大小的位點(diǎn)高2.89倍，視網(wǎng)膜中關(guān)鍵的光感受器特異性基因NRL主要在活性組蛋白標(biāo)記和染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的大型SE中富集，與CRE或隨機(jī)區(qū)域相比，TF結(jié)合位點(diǎn)主要存在于SE中，其中編碼許多具有豐富結(jié)合基序TF的基因也與SE重疊，這表明它們?cè)诰S持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)方面的潛在作用。

4、SE在TAD內(nèi)部loops富集并參與基因表達(dá)調(diào)控

以往研究表明SE可能會(huì)與其他調(diào)節(jié)區(qū)域互作，形成能夠調(diào)節(jié)多個(gè)基因的大型轉(zhuǎn)錄單元。視網(wǎng)膜SE在距離較小的loops中富含，并廣泛存在與loops內(nèi)的互作，幾乎所有SE參與內(nèi)部互作的loops都小于1Mb，并且大多數(shù)SE主要在TAD中存在交互。

與隨機(jī)區(qū)域相比較，SE在調(diào)節(jié)相互作用中大量富集，與3,059個(gè)獨(dú)特的CRE、1個(gè)獨(dú)特的TSS和217個(gè)獨(dú)特的SE互作。在視網(wǎng)膜和/或大腦中特異性表達(dá)的基因大多與SE重疊，而與SE相互作用但不重疊的基因則是一些常規(guī)基因，也有一些SE與許多CRE相互作用，因此可能在協(xié)調(diào)基因表達(dá)模式方面發(fā)揮重要作用，這些結(jié)果均表明人視網(wǎng)膜中SE的組織特異性和調(diào)控獨(dú)特性。

5、SE的TAD內(nèi)定位與靶基因的邊界絕緣和生物學(xué)功能有關(guān)

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)SE與桿狀細(xì)胞基因有關(guān)，反映了人類視網(wǎng)膜樣本中桿狀細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。研究還證明了SE靶基因的生物學(xué)功能可能與TAD中的SE定位以及TAD邊界絕緣有關(guān)。在TADs的邊緣，SEs的存在是與較弱的絕緣有關(guān)，與其他類型TAD相比，我們發(fā)現(xiàn)含SE的TAD中有更多的染色質(zhì)相互作用。值得注意的是，SE本身大多與位點(diǎn)的相互作用非常接近，表明在局部、TAD邊緣有很強(qiáng)的絕緣性，可能是由于CTCF結(jié)合的富集和避免附近基因的隨機(jī)激活，這與之前的研究一致。

SE靶向基因功能研究，即TSS與SE重疊或相互作用的基因，發(fā)現(xiàn)SE處在邊緣的TAD中都是富含應(yīng)激反應(yīng)基因，而視網(wǎng)膜基因主要在SE處于中心的TAD中富集，其中應(yīng)激反應(yīng)FOS重疊的SE位于TAD的邊緣，該TAD可能會(huì)受到超出自身TAD邊界的區(qū)域變化的影響。

6、染色質(zhì)loops、SEs和CREs與視網(wǎng)膜 eQTLs的聯(lián)合分析

eQTL將特定的遺傳變異與目標(biāo)基因表達(dá)的變化聯(lián)系起來(lái)（下文稱為eGene），為了識(shí)別可能與視網(wǎng)膜基因調(diào)節(jié)相關(guān)的eQTL，結(jié)合14,859個(gè)視網(wǎng)膜eQTLs，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)視網(wǎng)膜eQTL都存在于活躍的染色質(zhì)中，并駐留在同一個(gè)TAD中，這為解釋基因變體對(duì)eGene的影響提供了直接機(jī)制。此外，評(píng)估了變異與其eGene的啟動(dòng)子區(qū)域（距離TSS±2.5kb）之間的物理距離，能夠區(qū)分啟動(dòng)子eQTL、遠(yuǎn)端eQTL和與啟動(dòng)子相互作用的遠(yuǎn)端eQTL。分別確定了2,410個(gè)CRE（CRE-eQTL）和880個(gè)SE（SE-eQTL）特殊的eQTL，其中58.5%的CRE-eQTL和69.3%的SE-eQTL也與相關(guān)的eGene相交?？傮w而言，大多數(shù)eQTL在物理上與eGene或其啟動(dòng)子重疊或者通過(guò)染色質(zhì)loops互作接近各自的eGene。

7、基因組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)將目標(biāo)基因與AMD和青光眼相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)變異進(jìn)行關(guān)聯(lián)

關(guān)于青光眼和AMD的GWAS研究已經(jīng)確定了大量的非編碼變異，包括eQTLs分析在內(nèi)的其他研究提供了進(jìn)一步見(jiàn)解，但許多相關(guān)位點(diǎn)的目標(biāo)基因和變異仍然難以捉摸。研究人員將染色質(zhì)互作與從GWAS研究中識(shí)別的遺傳變異數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，并對(duì)帶有GWAS先導(dǎo)和LD變體的成人視網(wǎng)膜基因組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)先前未知的可能與青光眼和AMD有關(guān)的基因。例如，研究展示了一個(gè)顯著的遠(yuǎn)程相互作用導(dǎo)致目標(biāo)基因變化的青光眼相關(guān)基因TFAP2B/PKHD1。此外，小鼠中TFAP2B表達(dá)的中斷導(dǎo)致與青光眼一致的強(qiáng)烈病理表型，這些發(fā)現(xiàn)指向了與這些疾病相關(guān)的特定候選致病基因。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了AMD的候選致病基因，在CTRB2/CTRB1位點(diǎn)建立了CFDP1作為AMD相關(guān)的候選基因。

總結(jié)

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將高分辨率Hi-C數(shù)據(jù)與表觀遺傳圖譜和順式調(diào)控元件整合，為人類視網(wǎng)膜研究提供了一個(gè)重要的數(shù)據(jù)資源，促進(jìn)了基因組調(diào)控的研究。研究團(tuán)隊(duì)識(shí)別了視網(wǎng)膜病變中缺失的遺傳性，以及包括AMD和青光眼在內(nèi)的常見(jiàn)致盲疾病的候選因果基因和變異，該研究為將調(diào)控變異與視網(wǎng)膜疾病表型聯(lián)系起來(lái)提供了一個(gè)框架。整合的基因組調(diào)控圖譜還將有助于評(píng)估與其他常見(jiàn)視網(wǎng)膜相關(guān)疾病(如糖尿病視網(wǎng)膜病變)相關(guān)的基因，確定缺失的遺傳性，并了解遺傳性視網(wǎng)膜和黃斑疾病的基因型-表型相關(guān)性。

這項(xiàng)研究的首席研究員Anand Swaroop教授說(shuō):“這是視網(wǎng)膜調(diào)控基因組拓?fù)渑c老年性黃斑變性(AMD)和青光眼相關(guān)的遺傳變異的首次詳細(xì)整合，這兩種基因變異是視力喪失和失明的兩個(gè)主要原因?！盨waroop說(shuō):“擁有如此高分辨率的基因組結(jié)構(gòu)圖像，將繼續(xù)為組織特異性功能的基因控制提供見(jiàn)解?！?/p>

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