scRNA-seq助力解析馬間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的功能異質(zhì)性

 

研究背景

幾十年來，利用間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)的組織工程和再生醫(yī)學(xué)被認(rèn)為在各種疾病的臨床應(yīng)用前景廣闊，然而，大量的表型和功能的批次之間的差異阻礙了基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的效率和可重復(fù)性（Arezoo?et?al.，?2017，Arezoo?et?al.，?2018，Wei?et?al.，?2018）。MSC治療的療效被認(rèn)為取決于從不同組織來源分離的MSC培養(yǎng)物和從同一組織來源分離的MSC的異質(zhì)性，MSC異質(zhì)性通常通過形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、分化潛能和選擇基因表達(dá)模式來評(píng)估（Ho?et?al.，?2008，Meirav?et?al.，?2011）。單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)是一種用于解剖細(xì)胞異質(zhì)性的強(qiáng)大工具（Barrett?et?al.，?2019），但是到目前為止，還沒有關(guān)于供體匹配的組織來源的小鼠間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)的報(bào)道（Zhou?et?al.，?2019），為了克服從不同組織來源收集供者匹配的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的實(shí)際障礙，馬是很好的模型。

美國康奈爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院貝克動(dòng)物健康研究所Van?de?Walle研究團(tuán)隊(duì)于2020年12月4日在Stem?Cell?Research?&?Therapy上發(fā)表了解析MSC異質(zhì)性的研究進(jìn)展。文章利用了scRNA-seq等技術(shù)探索三個(gè)不同組織來源（AT、BM、PB）的原代馬間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的源間和源內(nèi)異質(zhì)性，并確定了檢測到的轉(zhuǎn)錄差異與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)功能的表型變異相對(duì)應(yīng)，這將提高M(jìn)SC?治療潛力，加速其從實(shí)驗(yàn)室到臨床的過渡。

研究方法

在本研究中，作者從健康成年溫血母馬的脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）3種組織中分離出MSCs，基于scRNA-seq檢測到的轉(zhuǎn)錄差異，進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)以檢查不同MSC群體的運(yùn)動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)功能。

研究結(jié)論

來自三個(gè)不同組織來源的MSC培養(yǎng)物之間連接粘附分子2（JAM2）的差異表達(dá)轉(zhuǎn)化為BM來源的MSC的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性改變?；

來自相同組織來源的克隆MSC系中CXCL6表達(dá)的差異與PB衍生的MSCs的化學(xué)吸引能力相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)材料

材料：從健康成年溫血母馬的脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）3種組織中收集初生馬間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs?)，無生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)3個(gè)樣本。

方法：scRNA-seq，siRNA敲除，RT-PCR，Western?blotting，細(xì)胞增殖、粘附測定，細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆和細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

研究結(jié)果

1.?scRNA-seq數(shù)據(jù)揭示了從供體匹配的組織來源分離的MSCs的來源間變異

從健康成年溫血母馬的脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）3種組織中收集初生馬間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs?)，共3個(gè)樣本，并根據(jù)它們分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的潛力以及細(xì)胞蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行表征實(shí)驗(yàn)，幾乎沒有觀察到MSCs的源間或源內(nèi)變化(Fig.?1a(i))。對(duì)來自骨髓，脂肪和外周血組織的MSCS進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，?結(jié)果顯示MSC標(biāo)記基因ITGB1、CD44、THY、ENG和B2M基因在每個(gè)組織中都有大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)（Fig.?1a(ii)）?；?0x?genomic平臺(tái)進(jìn)行了scRNA-seq分析，scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了流式細(xì)胞儀結(jié)果(Fig.?1b)。為了進(jìn)一步揭示了MSCs的來源間變異，作者分析了三種組織來源的所有scRNA-seq數(shù)據(jù)，采用無監(jiān)督聚類將細(xì)胞劃分為3個(gè)細(xì)胞亞群。聚類結(jié)果顯示細(xì)胞主要是通過來源組織聚集在一起的，將不同樣本用不同顏色標(biāo)出恰好得到每個(gè)cluster幾乎完全對(duì)應(yīng)著一個(gè)樣本(Fig.?2a)。熱圖顯示三個(gè)不同組織之間顯著差異表達(dá)基因（DEGs）(Fig.?2b)，分別在AT、BM和PB來源的骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞中檢測到37、35和20個(gè)DEGs。對(duì)每個(gè)組織來源分離的MSC中前5個(gè)DEGs表達(dá)水平進(jìn)行小提琴圖展示(Fig.?2c)。

 

2.?連接粘附分子2（JAM2）調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)表型

scRNA-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JAM2相對(duì)于PB衍生的MSCs和AT衍生的MSCs，在BM衍生的MSCs中的表達(dá)水平顯著更高(Fig.?2c)，作者在組間顯著差異表達(dá)的基因里邊挑選出了連接粘附分子2（JAM2），JAM2基因編碼JAM-2/JAM-B蛋白，有研究表明JAM-2在擴(kuò)散、粘附、遷移和入侵的各種過程中發(fā)揮作用，作者通過RT-PCR驗(yàn)證了來自這三種不同組織來源的MSCs中JAM2的表達(dá)模式。為了探索JAM2在MSC生物學(xué)中的作用，作者首先測定來自供體匹配脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）的MSCs中細(xì)胞增殖率的基線測量(Fig.?3a(i))，細(xì)胞粘附力(Fig.?3a(ii))，細(xì)胞入侵能力(Fig.?3a(iii))，以及細(xì)胞遷移能力(Fig.3a(iv))。然后作者使用RNA干擾(RNAi)來降低BM衍生的MSCs中JAM2的表達(dá)并做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除JAM2對(duì)BM來源的MSCs增殖沒有顯著影響(Fig.?3b(i))，它也沒有改變粘附強(qiáng)度(Fig.?3b(ii))，但JAM2的敲除導(dǎo)致入侵能力增強(qiáng)(Fig.?3b(iii))，BM來源的MSCs遷移減少(Fig.3b(iv))，表明JAM-2調(diào)節(jié)BM來源的MSCs的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)表型?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明JAM2參與了BM衍生的MSCs的細(xì)胞侵襲和遷移。除了差異基因表達(dá)外，作者表明MSCs的源間異質(zhì)性轉(zhuǎn)化為生物學(xué)相關(guān)的MSC功能，例如與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的功能。

3.?scRNA-seq數(shù)據(jù)揭示了從供體匹配組織來源分離的馬骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的來源內(nèi)變異

無監(jiān)督聚類分別將AT來源的MSCs、BM來源的MSCs和PBM來源的MSCs聚類為7，7，10個(gè)clusters(Fig.?4a)。根據(jù)作者最初的分析中，細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)聚類有很大的影響（Kowalczyk?et?al.，?2015）。在本研究中作者也觀察到一些明顯由與增殖一致的基因表達(dá)模式定義的簇(Fig.?4b)，因此，作者進(jìn)一步分析了G1?clusters和G2M/S?clusters，以確定不同細(xì)胞周期分類的簇間差異基因表達(dá)模式。在這種分組策略下，差異基因表達(dá)測試顯示來自AT、BM和PB衍生的MSCs中存在明顯的源內(nèi)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，盡管在AT來源的MSCs中差異較小，差異表達(dá)基因?(DEGs)?以熱圖的形式進(jìn)行展示?(Fig.?5)。為了檢查檢測到的clusters的假定生物學(xué)功能，作者對(duì)每個(gè)組織中的每個(gè)cluster進(jìn)行了GO功能富集分析，其中BM來源的MSCs中排名最靠前的是cluster2的細(xì)胞遷移和cluster3中的慢性炎癥反應(yīng)，PB來源的MSCs中排名靠前的是cluster4的蛋白組折疊和cluster6中的趨化性調(diào)節(jié)，AT來源的MSCs沒有檢測到任何顯著富集的GO?terms，表明檢測到的clusters之間的轉(zhuǎn)錄差異極小。

4.?PB衍生MSC的克隆異質(zhì)性揭示了趨化能力的功能差異

在PB-MSC和BM-MSC分析中顯著富集的GO?terms中，作者注意到與細(xì)胞遷移和趨化性相關(guān)的功能。作者使用體外限制性稀釋細(xì)胞克隆試驗(yàn)來產(chǎn)生克隆的PB衍生MSC系，用于下游功能性趨化性試驗(yàn)，探索MSC趨化活性可能的功能源內(nèi)變異。根據(jù)scRNA-seq分析結(jié)果，從單個(gè)PB來源的MSCs中產(chǎn)生14個(gè)克隆細(xì)胞系，并通過RT-PCR評(píng)估各種趨化相關(guān)基因的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)?C-X-C?基序趨化因子配體?6?(CXCL6)，一種參與粒細(xì)胞募集的分子，相對(duì)于其他克隆，在克隆?5?中的表達(dá)水平顯著更高(Fig.?6a)，這與scRNA-Seq檢測PB-MSC群體中少數(shù)細(xì)胞中CXCL6的表達(dá)一致(Fig.?6b-d)。將骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞添加到帶有3μm孔插入物的transwell板的下孔中，該孔插入物接種有馬中性粒細(xì)胞。作者觀察到，與CXCL6?low?MSCs相比，CXCL6?hi?MSCs刺激中性粒細(xì)胞遷移到顯著更高的水平，而大量原始MSC培養(yǎng)刺激中性粒細(xì)胞遷移到中等水平(Fig.?6e)。當(dāng)使用從?CXCL6hi?MSC?收集的條件培養(yǎng)基（CM）進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，觀察到了類似的結(jié)果(Fig.?6f)，表明骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞對(duì)趨化性的影響不需要直接接觸細(xì)胞。

這些結(jié)果表明，MSCs中的CXCL6表達(dá)水平與體外增加的中性粒細(xì)胞遷移相關(guān)，并提供了概念驗(yàn)證，即PB衍生的MSCs中的源內(nèi)異質(zhì)性轉(zhuǎn)化為生物學(xué)相關(guān)功能，例如與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的功能。

總結(jié)

本研究首次使用scRNA-seq技術(shù)來比較從單個(gè)供體的3個(gè)不同組織來源分離的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞?(MSCs)?的表達(dá)譜，單細(xì)胞分辨率下的基因表達(dá)譜表明，來自不同組織來源的MSCs在轉(zhuǎn)錄上是不同的，來自同一組織來源的MSCs也表現(xiàn)出基因表達(dá)的差異。來自三個(gè)供體匹配組織來源的MSC培養(yǎng)物之間JAM2的差異表達(dá)轉(zhuǎn)化為BM衍生的MSCs的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性改變，證明JAM2調(diào)節(jié)BM來源的MSCs的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)表型。此外，來自相同組織來源的克隆MSC系中CXCL6表達(dá)的差異與PB衍生的MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)。綜上，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)可以為功能研究提供理論基礎(chǔ)，更好地了解賦予MSC特定治療有益特性的細(xì)胞異質(zhì)性以及開發(fā)捕獲和擴(kuò)展具有這些特性的特定MSCs的方法。這些進(jìn)展將加速M(fèi)SC治療從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的工作臺(tái)轉(zhuǎn)移至臨床。

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參考文獻(xiàn)：

Harman?RM，?Patel?RS，?Fan?JC，?Park?JE，?Rosenberg?BR，?Van?de?Walle?GR.?Single-cell?RNA?sequencing?of?equine?mesenchymal?stromal?cells?from?primary?donor-matched?tissue?sources?reveals?functional?heterogeneity?in?immune?modulation?and?cell?motility.?Stem?Cell?Res?Ther.?2020?Dec?4;11(1):524.

doi:?10.1186/s13287-020-02043-5.

PMID:?33276815;

PMCID:?PMC7716481.