轉(zhuǎn)錄組+代謝組聯(lián)合解析柑橘類果實(shí)的油斑病損傷過程中木質(zhì)素的積累機(jī)制

研究背景

油斑病是發(fā)生在許多柑橘果實(shí)收獲前的成熟和收獲后的貯藏期間的一種生理性疾病，尤其是在生理成熟不足時(shí)采摘的酸橙、檸檬和橙子，影響柑橘果實(shí)外觀品質(zhì)，常伴有柑橘類皮的木質(zhì)化。油斑病典型癥狀為油腺破裂、相鄰表皮凹陷伴組織壞死、油腺突出，以及形成不規(guī)則形狀的黃棕色斑點(diǎn)。油斑病可由幾種類型的損傷引起，例如采前非生物脅迫（風(fēng)、冰雹）造成的損傷和采后處理不當(dāng)造成的機(jī)械損傷，尤其是當(dāng)果皮在高膨壓下受損時(shí)。研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素參與抵御生物和非生物脅迫的防御機(jī)制，有報(bào)道稱，受損或感染的柑橘果皮中木質(zhì)素積累增強(qiáng)，然而，在柑橘類果實(shí)黃化過程中木質(zhì)素積累的分子機(jī)制仍不清楚。

檸檬世界上一種重要的園藝作物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和健康物質(zhì)。青檸檬中油斑病的發(fā)病率很高，采后油斑病的發(fā)生是青檸檬生產(chǎn)和發(fā)展的主要瓶頸。因此，作者通過代謝組學(xué)分析來研究初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和組織化學(xué)分析來探索青檸檬果實(shí)的油斑病損傷中木質(zhì)素的積累。然后，通過接種青霉來研究油斑病對(duì)病原體耐藥性的影響，從形態(tài)學(xué)、代謝和分子水平上分析了油斑病損傷后木質(zhì)素積累的機(jī)制。

材料方法

實(shí)驗(yàn)材料:云寧1號(hào)青檸檬，采自中國(guó)云南省紅河州。

實(shí)驗(yàn)方法：初級(jí)代謝物分析采用GC-MS的方法測(cè)定初級(jí)代謝物；次級(jí)代謝物分析：LC-QTOF-MS法；木質(zhì)素總含量測(cè)定：280nm吸光度法；木質(zhì)素形態(tài)和分布的組織化學(xué)分析：顯微鏡成像；RNA測(cè)序：Illumina HiSeq2500。

主要研究結(jié)果與分析

1、油斑病對(duì)初級(jí)代謝物組成的影響

主成分分析顯示健康和油斑病損傷的檸檬皮的初級(jí)代謝物含量存在明顯差異，輕度油斑病的主要代謝產(chǎn)物與重度油斑病的主要代謝產(chǎn)物也明顯分離，但與中度油斑病的主要代謝產(chǎn)物無明顯差異(Fig. 2A)。在健康和油斑病損傷的檸檬皮中共檢測(cè)到41種初級(jí)代謝物，包括有機(jī)酸、糖、氨基酸和醇等。與健康檸檬皮相比，輕度、中度和重度油斑病的初級(jí)代謝物總含量分別降低了21.8%、25.8%和20.8%，主要的初級(jí)代謝產(chǎn)物為油斑病中的糖和有機(jī)酸；有機(jī)酸總含量分別下降了29.6%、30.9%和32.1%，糖類總含量分別下降了16.9%、21.1%和13.7%。輕度、中、重度油斑病檸檬皮的有機(jī)酸和糖總含量無顯著差異。

所有樣品中共檢測(cè)到13種有機(jī)酸(Fig. 2B)，其中奎寧酸含量最多，其次是蘋果酸。除草酸和棕櫚酸外，油斑病損傷檸檬皮中大多數(shù)有機(jī)酸水平較低，但輕、中、重度油斑病檸檬皮間無顯著差異。所有樣品中均檢測(cè)到10個(gè)氨基酸(Fig. 2B)，除與脅迫相關(guān)的氨基酸如脯氨酸、伽氨基丁酸和谷氨酸外，其余氨基酸均顯著增加(Fig. 3B)。輕度、中度和重度油斑病檸檬皮中脯氨酸含量分別為健康檸檬皮的1.34、1.36和1.64倍。

此外，在健康和油斑病損傷的檸檬皮中檢測(cè)到18種糖和醇(Fig. 2B)。除果糖、蔗糖、半乳糖、甘油和松果醇外，大部分糖含量顯著下降，隨著油斑病嚴(yán)重程度的增加而逐漸增加。與健康檸檬皮相比，輕度、中度和重度油斑病檸檬皮的葡萄糖含量分別下降了43.1%、51.9%和51.8%。以上結(jié)果表明，柑橘類油斑病的發(fā)生降低了初級(jí)代謝物的總含量，和大多數(shù)主要代謝物例如葡萄糖、奎寧酸和蘋果酸等含量顯著下降，但蔗糖、脯氨酸、GABA和谷氨酸等在油斑病損傷的檸檬皮中含量升高外。

2、油斑病對(duì)次生代謝產(chǎn)物組成的影響

被油斑病損傷的檸檬皮的顏色變成棕色，伴隨著酚類和木質(zhì)素含量的變化。為了評(píng)價(jià)油斑病對(duì)次生代謝物的影響，采用LC-QTOF-MS法測(cè)定其次生代謝產(chǎn)物的種類和含量。在健康和油斑病受損的檸檬皮中共檢測(cè)到51種代謝物，包括3種初級(jí)代謝物和48種次級(jí)代謝物。PCA分析顯示健康和油斑病之間存在明顯的分離(Fig. 3A)。以上結(jié)果表明，油斑病引起檸檬皮的次生代謝物的變化較大，但油斑病程度對(duì)次生代謝物的分布沒有顯著影響。

次生代謝產(chǎn)物組成分析表明，油斑病增加了次生代謝產(chǎn)物的含量。與健康檸檬皮化合物相比，油斑病檸檬皮的化合物的次生代謝物前體(包括酪氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸)明顯減少(Fig.3B)，同時(shí)，大量次生代謝物的積累也更加顯著，包括水楊酸、3-甲氧基肉桂酸、丁香酸、芥子酸、對(duì)香豆酸、香蘭素、綠原酸、松柏素等，尤其是木質(zhì)素單體成分。重度油斑病檸檬皮化合物中丁香酸、丁香苷和針葉素含量分別為健康檸檬皮化合物的1.25倍、1.29倍和5.57倍，而輕度、中度和重度油斑病檸檬皮化合物中丁香酸、丁香苷和針葉素含量差異不顯著。此外，幾種次生代謝產(chǎn)物在油斑病損傷的檸檬皮中略有增加，但與健康檸檬皮無顯著差異

3、油斑菌病對(duì)檸檬皮中木質(zhì)素積累的影響

為了從形態(tài)學(xué)角度揭示油斑病對(duì)檸檬皮中木質(zhì)素積累的影響，采用間苯三酚-鹽酸反應(yīng)對(duì)健康和油斑病檸檬皮的橫截面進(jìn)行了木質(zhì)素化研究。在染色前，健康檸檬皮的細(xì)胞排列整齊，沒有塌陷，而輕度油斑病檸檬皮的細(xì)胞似乎塌陷并堆積在一起。隨著油斑病嚴(yán)重程度的增加，細(xì)胞的堆積越來越明顯，細(xì)胞間組織的塌陷導(dǎo)致不同程度的破裂，特別是在油斑病嚴(yán)重的檸檬皮中，可以觀察到許多裂痕洞（Fig. 4）。

為進(jìn)一步證實(shí)油斑病對(duì)檸檬皮中木質(zhì)素積累的影響，測(cè)定了不同油斑病程度檸檬皮中木質(zhì)素含量。結(jié)果表明，油斑菌病顯著提高了木質(zhì)素含量，且呈程度依賴性。中度油斑病檸檬皮與輕度和重度油斑病的檸檬皮的木質(zhì)素含量無顯著差異。與對(duì)照組相比，輕度、中度和重度油斑病的檸檬皮中總木質(zhì)素含量分別顯著增加了51.2%、69.7%和79.6%(Fig. 5)，這與染色結(jié)果一致。

4、健康和油斑菌病損傷檸檬皮的基因表達(dá)模式

為了從分子水平研究油斑病損傷檸檬皮代謝產(chǎn)物的基因調(diào)控機(jī)制，對(duì)健康和嚴(yán)重油斑病檸檬皮進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。在健康檸檬皮和油斑病損傷檸檬皮中共鑒定到2198個(gè)上調(diào)和1415個(gè)下調(diào)的DEGs。1810個(gè)DEGs被注釋到已知的代謝途徑，其中GO生物過程中與生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控、甲殼素分解代謝過程、氧化還原過程、肉桂酸生物合成過程、木質(zhì)素生物合成過程和碳水化合物代謝過程顯著富集。KEGG通路包括苯丙氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、糖代謝和糖酵解/糖異生、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合生物的碳固定豐顯著富集(Fig. 6)。

5、與糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因

糖酵解和磷酸戊糖途徑是葡萄糖分解代謝的兩個(gè)重要途徑，糖酵解是果實(shí)生命活動(dòng)的核心代謝途徑。PCKA基因顯著上調(diào)，促進(jìn)了油斑病損傷檸檬皮中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生成。PEP中磷酸在丙酮酸激酶(PK)的催化下發(fā)生轉(zhuǎn)移，然后在丙酮酸脫羧酶(PDC)、丙酮酸脫氫酶E2組分(PDHC)、醛脫氫酶(NAD+) (ALDH)的作用下生成丙酮酸和乳酸。糖酵解途徑中大部分的DEG被上調(diào)，糖酵解在油斑病的檸檬皮中增加。此外，磷酸戊糖途徑是葡萄糖分解代謝的另一個(gè)分支。葡萄糖通過磷酸戊糖途徑分解生成磷酸赤蘚，葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)是該途徑的關(guān)鍵限速酶。檸檬皮中6PGDH基因表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)了葡萄糖的分解和赤蘚4-磷酸的產(chǎn)生。這些結(jié)果可以解釋代謝組分析結(jié)果中葡萄糖含量顯著下降的原因。

糖酵解產(chǎn)生的PEP和4-磷酸赤蘚是合成苯丙氨酸和酪氨酸的前體物質(zhì)，除酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因TAT外，其他基因均顯著上調(diào)。在這一途徑中，3-脫氧-7磷酸七酸合酶(DAHP)和3-脫氫喹酸脫氫酶/莽草酸脫氫酶(DHQ-SDH)是關(guān)鍵的限速酶，在油斑病損傷檸檬皮中顯著上調(diào)，表明莽草酸途徑被激活，促進(jìn)了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的積累。然而，代謝數(shù)據(jù)顯示，苯丙氨酸和酪氨酸在油斑病損傷檸檬皮中顯著減少。這是因?yàn)楸奖彼岷屠野彼崾潜奖卮x途徑中的前體，并可能繼續(xù)合成其他物質(zhì)。

6、與木質(zhì)素積累相關(guān)的差異表達(dá)基因

苯丙烷代謝是連接一級(jí)代謝和二級(jí)代謝、合成類黃酮和木質(zhì)素的最關(guān)鍵的代謝途徑，而苯丙素生物合成是KEGG通路中最富集的途徑。共鑒定出35個(gè)編碼苯丙氨酸代謝關(guān)鍵催化酶的基因，均為木質(zhì)素生物合成相關(guān)的上調(diào)基因。在木質(zhì)素特異性合成途徑中，阿魏酸-5-羥化酶(F5H)基因表達(dá)上調(diào)。在木質(zhì)素合成途徑下游，肉桂酰輔酶a還原酶(CCR)和過氧化物酶(POD)表達(dá)上調(diào)。此外，在木質(zhì)素單體合成的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，UDP -糖基轉(zhuǎn)移酶72E (UGT72E)的表達(dá)量在油斑病損傷檸檬皮中顯著升高，這些基因均與木質(zhì)素積累呈顯著正相關(guān)(Fig. 7)。綜上所述，油斑病的發(fā)生主要通過增加苯基丙烷代謝途徑和木質(zhì)素合成特異途徑的基因表達(dá)來影響檸檬皮中木質(zhì)素的積累。

7、油斑病對(duì)青霉菌癥狀的影響

檸檬皮在油斑病中積累了大量的抗性物質(zhì)。為了進(jìn)一步說明油斑病對(duì)果實(shí)抗性的影響，對(duì)健康和油斑病受損的檸檬皮為例進(jìn)行了接種。結(jié)果表明，接種5 d后，健康檸檬皮接種部位周圍有小病變區(qū)，青霉孢子較多，有水漬圈，油斑病受損檸檬皮接種部位也有小病變區(qū)，但沒有水漬圈(Fig. 8)。8 d后，健康檸檬皮的病變面積和水漬圈明顯擴(kuò)大，而油斑病受損的檸檬皮病變面積和水漬圈沒有明顯變化。接種后9 ~ 10 d，病變面積和水漬圈不斷增大;結(jié)果，果實(shí)軟化腐爛。但油斑病仍表現(xiàn)出較高的硬度，病變面積沒有擴(kuò)大，青霉孢子的粘附和生長(zhǎng)受到明顯抑制。

總結(jié)

本研究采用多種生物學(xué)方法對(duì)青檸檬油斑病木質(zhì)素積累的機(jī)制進(jìn)行了分析。油斑病損傷檸檬皮的初級(jí)代謝物（尤其是葡萄糖）顯著降低，次級(jí)代謝物（尤其是木質(zhì)素）顯著增加。檸檬皮在油斑病下發(fā)生嚴(yán)重的木質(zhì)化，苯丙素的生物合成被顯著激活，與木質(zhì)素積累相關(guān)的DEGs有79個(gè)，其中65個(gè)基因顯著上調(diào)，尤其是PAL、C4H、CCR、F5H POD和UGT72E基因。油斑病損害的檸檬皮具有較高水平的木質(zhì)素積累和增強(qiáng)對(duì)病原真菌的防御。該研究是首次報(bào)道檸檬油斑病對(duì)病原真菌表現(xiàn)出較高的抗性。

 

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