文獻解讀 | 真菌溶菌酶利用腸道微生物群抑制DSS誘導的結腸炎

英文題目：Fungal lysozyme leverages the gut microbiota to curb DSS-induced colitis

發(fā)表雜志：Gut Microbes

影響因子：10.302

發(fā)表時間：2021年10月25日

導讀

結腸炎的主要癥狀是結腸炎癥和腸道健康受損，這兩種特征都會加劇肥胖和胰島素抵抗。宿主防御肽(HDPs)是腸道穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子，在上述情況下通常會出現(xiàn)故障。溶菌酶是一種來自A.alcalophilum特征良好的HDP，本研究的目的在于通過每日口服溶菌酶來改善飲食誘導的肥胖和化學誘導（DSS誘導）的結腸炎的腸功能。
對低脂飲食（LFD）和高脂飲食（HFD）的小鼠，每日灌胃溶菌酶12周并設置對照組，然后進行代謝評估和結腸微生物群侵入評估。為了進一步評估溶菌酶在腸道炎癥的療效，在DSS誘導的常規(guī)小鼠和微生物群缺失小鼠的結腸炎期間，對其補充溶菌酶，通過16S擴增子測序評估了兩種模型中縱向微生物組的改變。
研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶可劑量依賴性地減輕DSS刺激小鼠的腸道炎癥，可通過黏液的產(chǎn)生抑制HFD誘導的微生物群侵犯或易位，并可預防空腹高胰島素血癥。同時研究也發(fā)現(xiàn)溶菌酶保護腸道健康依賴于一些復雜的腸道菌群。

在HFD和DSS兩種模型中，Akkermansia muciniphila都與腸道健康受損有關，而溶菌酶可以緩解這種情況，同時，PICRUSt2功能預測結果也顯示溶菌酶給藥會持續(xù)影響一些特定途徑。
總的來說，該研究表明A.alcalophilum來源的溶菌酶是一個非常有應用前景的促進腸道健康的候選物質。

材料與方法

實驗材料：

C57BL6/J小鼠適應低脂參考飲食（LFD）和高脂參考飲食（HFD）后，每日灌注溶菌酶，之后進行代謝評估和結腸微生物群侵蝕評估。

為了進一步評估這種溶菌酶對腸道炎癥的療效，研究者接下來對DSS誘導的常規(guī)小鼠或微生物耗盡的BALB/c小鼠補充溶菌酶。

6周齡的雄性C57BL6/J小鼠或雌性BALB/c小鼠進行2周飲食適應后：
● C57BL6/J小鼠部分轉為高脂飲食（HFD），其余保持低脂飲食（LFD）；口腔灌胃溶菌酶和對照物，處理至第12周；
分組：HFD+Lyso；HFD+Vehicle；LFD+Lyso；LFD+Vehicle

● BALB/c小鼠：DSS誘導分組：Lyso組，Vehicle組；微生物區(qū)系耗盡小鼠分組：Lyso組，Vehicle組。

主要方法：

生理生化實驗、組織細胞因子定量、qPCR、FISH、16s rRNA基因擴增子測序、組織病理分析

主要研究結果

1. 溶菌酶可以緩解飲食誘導的空腹高胰島素血癥，增加黏液的產(chǎn)生，減少其它微生物群的侵蝕

該文章首先研究了溶菌酶對飲食誘導型肥胖小鼠的潛在影響。研究結果發(fā)現(xiàn)，與喂食LFD的小鼠相比，喂食HFD的小鼠體重增加了更多，每天補充溶菌酶對身體成分或能量攝入沒有產(chǎn)生可測量的影響（圖1a），然而，接受溶菌酶治療的小鼠確實表現(xiàn)出了更低的空腹胰島素水平（圖1b）。與Vehicle+HFD組相比，溶菌酶更傾向于降低餐后血糖而不是空腹血糖。葡萄糖刺激的胰島素濃度不受溶菌酶補充的影響。與已知可以調節(jié)腸道滲漏的空腹胰島素減少類似，本文研究者們在溶菌酶灌胃的動物中觀察到HFD誘導的腸道通透性出現(xiàn)數(shù)值保護（圖1e）。這些體內跡象表明HFD喂養(yǎng)的小鼠腸道通透性增加，且循環(huán)LPS、腸炎癥以及與結腸和回腸緊密連接基因的表達在組間保持相似。盡管如此，溶菌酶還是使HFD誘導的結腸中Tlr2表達的減少維持在正常范圍內（圖1f）。根據(jù)已有研究顯示，TLR2的激活與結腸杯狀細胞的黏液調節(jié)有關，因此本文研究者們調查了黏液的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)補充溶菌酶可防止HFD誘導的結腸Muc2下調（圖1g）。進一步的，發(fā)現(xiàn)這種溶菌酶介導的黏液完整性保存，可能是由于腸上皮細胞到最近細菌的平均距離增加6倍以上導致，從而說明補充溶菌酶足以防止HFD引起的微生物區(qū)系侵蝕（圖1h-i）。

圖1. 溶菌酶降低C57BL6/J小鼠中與Tlr2和Muc2表達相關的空腹胰島素水平。

2. 溶菌酶逐步改變腸道微生物群組成及其預測功能

由于微生物區(qū)系侵蝕的減少也可能由于溶菌酶具有潛在的殺菌活性，因此本文研究者接下來評估了實驗小鼠糞便微生物群的縱向變化。在研究開始時，所有的小鼠都低脂喂養(yǎng)，且微生物組成分析顯示這些小鼠的微生物組成具有相似性。HFD喂養(yǎng)導致了小腸和糞便樣本中的微生物群組成產(chǎn)生了巨大差異（圖2a-d）。縱向抽樣顯示，飲食干預導致糞便微生物群發(fā)生即時變化，而溶菌酶給藥的影響逐漸顯現(xiàn)。與其他組相比，每天接受口服溶菌酶的小鼠，其微生物群落在結構上表現(xiàn)出獨特和漸進的軌跡（圖2c）。但盡管如此，除在小腸中，一些HFD誘導的糞便微生物變化可以通過補充溶菌酶來抵抗（圖2a-f）。微生物群的alpha多樣性不受溶菌酶給藥的影響，說明該溶菌酶沒有相應明顯的抗菌作用。與vehicle組小鼠相比，接受溶菌酶的小鼠糞便中大量細菌ASVs的相對豐度被修飾了，且受調控的ASVs大多屬于厚壁菌門，其中Akkermansia muciniphila和Oscillospira（顫螺菌屬）減少，胃瘤胃球菌屬的一種未分類的胃瘤胃球菌、假長雙歧桿菌和異歧桿菌的相對豐度則增加（圖2e）。此外，由于補充了溶菌酶，4個細菌屬顯示在整個屬水平都發(fā)生了ASVs豐度改變（圖2f），而其它的ASV修飾則呈現(xiàn)出物種依賴性。接下來，本文研究者們對細菌群落進行了功能預測，結果顯示接受溶菌酶的小鼠糞便樣本菌群預測功能發(fā)生了顯著變化，而小腸樣本中則沒有顯著變化（圖2g和圖3f）。

圖2. 溶菌酶影響HFD喂養(yǎng)C57BL6/J小鼠的腸道微生物群組成和預測功能

圖3. 劑量依賴性溶菌酶可以防止DSS誘導的BALB/c小鼠結腸炎

3. 溶菌酶劑量依賴性地預防DSS誘導的結腸炎

為了進一步研究補充溶菌酶對腸道健康的有益效果，本文中研究者們評估了化學誘導（DSS誘導）的輕度結腸炎中的結腸損傷。設置了兩種劑量（1.0mg和0.4mg）的溶菌酶。在體重方面，發(fā)現(xiàn)接受1.0mg溶菌酶在對DSS誘導的小鼠的有一定的保護作用（圖3a-b），而0.04mg劑量的溶菌酶雖然缺乏保護作用，但是仍能抑制腸道炎癥（圖3c-h）。研究者還在所有測量數(shù)據(jù)中觀察到一個高度一致的劑量依賴性趨勢（圖3a-h）。與對照組小鼠相比，1.0mg溶菌酶沒有引起結腸損傷或細胞因子水平的可測量變化，因此表明溶菌酶不影響健康小鼠的免疫穩(wěn)態(tài)（圖3c-h）。

4. 溶菌酶可以在一定程度上保護DSS誘導的微生物區(qū)系變化，并改變其預測功能

DSS誘導前，溶菌酶補充組和對照組的糞便微生物組成相似（圖4a）。而處理后（研究末期），研究者評估了回腸、盲腸和結腸中的腸道微生物組成，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表研究結果一致，這些部位的微生物群落結構發(fā)生了明顯的變化（圖4b）。與DSS誘導結腸炎的結腸靶點一致，DSS刺激誘導了遠端腸道的一致變化，但在回腸中只有輕微的變化（圖4b-c）。溶菌酶可以在一定程度上保護腸道微生物免受到DSS的影響（圖4b-c），對DSS相關的軌跡起到了保護作用，在Prevotella屬和Oscillospira屬中，被歸類為A. muciniphila的幾種ASV普遍減少，而研究者也觀察到R. gnavus的增加，從而使DSS刺激小鼠中的溶菌酶介導的改善情況與在HFD喂養(yǎng)小鼠中觀察到的特征相一致（圖4c-d）。腸道微生物群的預測功能與微生物群組成相似，在結腸樣本也是主要受溶菌酶的影響（圖4e和4k）。該研究確定了在HFD和DSS兩項研究中都存在的21條受調控的通路，其中13條均受到溶菌酶的調控。這些途徑持續(xù)影響與氨基酸和核苷酸/核苷相關合成，碳水化合物代謝的改變，以及涉及肽聚糖合成和成熟的三種不同的途徑。

圖4. 溶菌酶可一定程度上保護DSS對BALB/c小鼠微生物群組成的影響

5. 溶菌酶介導的緩解DSS誘導性結腸炎依賴于功能性的腸道微生物群

為了進一步研究腸道微生物群在溶菌酶介導的保護中所發(fā)揮的作用，探尋溶菌酶與微生物的關系，研究者設計添加了微生物群耗盡小鼠的研究組，這類小鼠的癥狀與DSS誘導的腸道損傷類似。盡管研究結果顯示受DSS刺激的Vehicle組的小鼠體重沒有減輕，但出現(xiàn)了與之前觀察結果相似的結腸炎表型(圖5a-c)。每日溶菌酶補充對DSS誘導的結腸縮短和脾臟重量以及宏觀和微觀下的結腸炎評分都有很強的保護作用(圖5a-g)。重要的是，雖然抗生素本身并不足以在體外抑制溶菌酶的活性，但在微生物區(qū)系耗盡的小鼠中，溶菌酶并沒有發(fā)揮保護作用（圖5h-n），這些數(shù)據(jù)很明顯地說明，溶菌酶對結腸炎的影響依賴于腸道微生物群。

圖5. 溶菌酶利用腸道微生物群來緩解DSS誘導的BALB/c小鼠結腸炎

總結與結論

總而言之，通過16s擴增子測序結合其它病理與生化實驗以及結腸炎癥狀，初步證實了A. alcalophilum來源的溶菌酶重塑了腸道微生物群組成及其預測功能，減少HFD誘導的腸道通透性和細菌入侵，以微生物和劑量依賴性地方式減少DSS誘導的結腸炎，該文章研究了此來源的溶菌酶對兩種不同品系的小鼠的有益影響。結合已發(fā)表的免疫調節(jié)特性，說明溶菌酶在改善腸道健康方面值得進一步研究以評估其臨床轉化的前景。

圖6 溶菌酶在HFD喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠和DSS誘導的結腸炎BALB/c小鼠中的作用

參考文獻

1. Larsen, Ida S?gaard et al. “Fungal lysozyme leverages the gut microbiota to curb DSS-induced colitis.” Gut microbes vol. 13,1 (2021): 1988836.
doi:10.1080/19490976.2021.1988836

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