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中文題目：轉(zhuǎn)錄組和脂質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析揭示小麥蠟質(zhì)調(diào)控機(jī)制
英文題目：Analysis of Wheat Wax Regulation Mechanism by Liposome and Transcriptome
期刊：frontiers in Genetics
影響因子：IF 4.599
研究背景介紹
表皮蠟作為植物的第一道屏障，在抵抗生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用，它可以限制非氣孔水分的損失，提高植物的抗旱性，幫助植物減少機(jī)械損傷、植物病蟲害，保護(hù)植物免受高溫和強(qiáng)紫外線輻射。表皮蠟是由超長(zhǎng)鏈脂肪酸（VLCFA）及其衍生物組成的復(fù)雜脂質(zhì)混合物?，F(xiàn)有研究表明，表皮蠟的生物合成始于質(zhì)體表皮細(xì)胞外膜上由超長(zhǎng)鏈脂肪酸C16或C18轉(zhuǎn)化的蠟質(zhì)前驅(qū)體，然后長(zhǎng)鏈脂肪酸通過酰基還原和脫羰基化合成不同的蠟狀化合物。在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)了許多參與蠟合成和調(diào)控的基因，如擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子WIN1/SHN1上調(diào)表皮蠟合成基因CER1、CER2、CER4、KCS、CYP86A7、CYP86A4、GPAT4、LACS2和HTH的表達(dá)，以誘導(dǎo)表皮蠟積累，在小麥中，由于基因組信息量巨大，對(duì)小麥表皮蠟生物合成的分子調(diào)控機(jī)制研究較少。為了研究小麥表皮蠟的調(diào)控機(jī)制，本研究以甲基磺酸乙酯（EMS）誘變22號(hào)冀麥獲得的低蠟突變體和多蠟突變體為材料，通過對(duì)非靶向脂質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組的相互驗(yàn)證和聯(lián)合分析，確定了小麥表皮蠟的主要成分，并挖掘出與表皮蠟代謝相關(guān)的新基因。
實(shí)驗(yàn)方法與材料
材料：EMS誘變22號(hào)高產(chǎn)品種冀麥，分離出蠟質(zhì)（waxy）和無蠟質(zhì)突變體（waxyless），種植至抽穗期取葉片組織。
測(cè)序策略：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序用Illumina測(cè)序平臺(tái)，非靶向脂質(zhì)組采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）檢測(cè)，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
分析策略：百邁客云平臺(tái)真核有參轉(zhuǎn)錄組APP，測(cè)序數(shù)據(jù)一鍵式投遞，云上個(gè)性化協(xié)助分析。
主要研究結(jié)果
1. 本研究對(duì)冀麥22號(hào)低蠟突變體和多蠟突變體的葉表皮蠟進(jìn)行了非靶向脂質(zhì)體檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄組分析。共鑒定出31個(gè)脂類亞類和1,367個(gè)脂類分子。
2. 小麥葉蠟的主要脂質(zhì)成分為WE 、DG 、TG、MG和OAHFA 。DG, MG, OAH FA首次在小麥葉片表皮蠟質(zhì)中進(jìn)行了研究。
3. 與蠟質(zhì)突變體相比，無蠟質(zhì)突變體共檢測(cè)到6840個(gè)DEGs，其中上調(diào)3181個(gè)DEGs，下調(diào)3659個(gè)DEGs。
4. 根據(jù)KEGG代謝途徑構(gòu)建小麥表皮主要蠟質(zhì)組分的代謝模式，篩選出KSC、TER、FAR、WSDCER1、MAH1、ALDH7A1、CYP704B1、ACOT1_2_4、CYP86等46個(gè)相關(guān)基因。
主要研究?jī)?nèi)容
一、葉表皮脂質(zhì)成分的鑒定與分析
通過UPLC分析，在兩個(gè)突變體的葉表皮中鑒定出31個(gè)脂質(zhì)亞類和1367個(gè)脂質(zhì)分子（圖1A）。具有大量脂質(zhì)種類的脂質(zhì)為三酰甘油（TG）、神經(jīng)酰胺（Cer）、二酰甘油（DG）、蠟酯（WE）、（O-?；?1-羥基脂肪酸（OAHFA）、單半乳糖基二酰甘油（MGDG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、膽固醇（ChE）、心磷脂（CL）、磷脂酰肌醇（PI），磷脂酰絲氨酸（PS）。其中，TG、Cer、DG、WE和OAHFA占分子總數(shù)的83%（圖1B）。此外，還發(fā)現(xiàn)小麥葉表皮的主要脂質(zhì)成分為TG、Cer、DG、WE和OAHFA。
圖1.小麥葉片脂質(zhì)亞類數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖
二、葉表皮蠟相關(guān)脂質(zhì)亞類的分析
通過比較抽穗期低蠟突變體和多蠟突變體的類脂亞類含量，篩選出類脂含量的顯著差異。在兩個(gè)突變體之間有11種脂類物質(zhì)存在顯著差異（VIP>1，p<0.05）。在低蠟突變體中，有六個(gè)高脂含量的脂質(zhì)亞類，即Cer、ZyE、PE、MGDG、CL和二半乳糖基二酰甘油（DGDG）。另一方面，在多蠟突變體中，發(fā)現(xiàn)五種脂質(zhì)類別為DG、ChE、OAHFA、WE和單酰甘油（MG）（VIP>1，p<0.05）。我們推斷，與無蠟小麥相比，蠟質(zhì)小麥具有更豐富和不同的脂質(zhì)作為小麥表皮蠟的主要成分。也就是說，抽穗期小麥葉表皮的主要脂質(zhì)成分是DG、ChE、OAHFA、WE和MG。
三、差異表達(dá)基因分析
通過對(duì)抽穗期低蠟突變體和多蠟突變體葉片轉(zhuǎn)錄組的分析，不同生物重復(fù)樣本之間的相關(guān)系數(shù)為0.890 ~ 0.926(圖2A)。與蠟質(zhì)突變體相比，無蠟突變體共檢測(cè)到6840個(gè)DEGs，其中3181個(gè)基因上調(diào)，3659個(gè)基因下調(diào)(Fold Change≥2,FDR <0.01)(圖2B)。對(duì)低蠟突變體和多蠟突變體的基因進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)生物過程中主要富集在代謝過程(28.89%)、細(xì)胞過程(24.73%)、單生物過程(14.96%)、生物
節(jié)(8.35%)和刺激反應(yīng)(6.46%)。這些基因主要分布在膜、膜部分、細(xì)胞、組成細(xì)胞部分和細(xì)胞器中。
此外，我們注釋了3659個(gè)DGE的脂質(zhì)功能，篩選了343個(gè)DGE，并使用KEGG富集分析對(duì)其進(jìn)行富集(圖2C,D)。研究發(fā)現(xiàn)，這些基因主要集中在甘油磷脂代謝、角質(zhì)層、亞油酸和蠟的生物合成、甘油脂代謝、鞘脂代謝、萜類主干生物合成、脂肪酸降解和脂肪酸伸長(zhǎng)途徑中，這與該研究中控制小麥葉片光澤表型的主要脂質(zhì)組分一致。
圖2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
四、蠟質(zhì)和差異表達(dá)基因的聯(lián)合分析
結(jié)合脂質(zhì)組分鑒定結(jié)果，在相應(yīng)的途徑上標(biāo)記注釋基因，根據(jù)KEGG代謝途徑構(gòu)建小麥表皮主要脂質(zhì)組分的代謝模型(圖3)，并篩選出46個(gè)相關(guān)基因。此外，與多蠟突變體相比，低蠟突變體中注釋到蠟酯合成（WE）的基因?yàn)?-酮酰基-CoA合酶基因（KCS），極長(zhǎng)鏈烯醇基輔酶A還原酶基因（TER）、醇形成脂肪酰輔酶A還原酶基因（FAR）、蠟酯合酶基因（WSD1）、醛脫羧酶基因（CER1）和中鏈烷烴羥化酶基因（MAH1）。TER的下調(diào)抑制長(zhǎng)鏈3氧?；o酶A向長(zhǎng)鏈?；o酶A（N2）的轉(zhuǎn)化，CER1的下調(diào)抑制上游長(zhǎng)鏈醛向長(zhǎng)鏈烷烴的轉(zhuǎn)化，KCS、FAR、WSD1和MAH1相關(guān)的表達(dá)基因均上調(diào)和下調(diào)。
在OAHFA合成過程中，?；o酶A硫代酯酶1/2/4基因（ACOT1_2_4）的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，而?；视椭久富颍∕GLL）的表達(dá)水平在單?；视娃D(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈脂肪酸的過程中上調(diào)和下調(diào)。醛脫氫酶家族7個(gè)成員A1基因(ALDH7A1)表達(dá)下調(diào)抑制了A長(zhǎng)鏈醛與長(zhǎng)鏈脂肪酸之間的過渡，醛脫氫酶基因(ALDH)則上調(diào)了A長(zhǎng)鏈醛與長(zhǎng)鏈脂肪酸之間的過渡。在長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-羥基脂肪酸的過程中，長(zhǎng)鏈脂肪酸ω-單加氧酶基因（CYP704B1）的表達(dá)下調(diào)，而突變無蠟脂肪酸ω-羥化酶基因（CYP86）的表達(dá)上調(diào)。甘油-3磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因（GPAT）和ALDH7A1在DG、MG和TG的甘油酯代謝過程中下調(diào)。在無蠟情況下，葡萄糖的表達(dá)下調(diào)抑制了1-?；?sn甘油3-磷酸的合成，從而減少了鎂的合成。ALDH7A1在低蠟突變體中的下調(diào)表達(dá)降低了DG的合成。上調(diào)基因?yàn)锳LDH、二酰甘油二磷酸磷酸酶基因（DPP1）和二酰甘油激酶基因（dgkA），而1-酰基-SN-甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶基因（plsC）的表達(dá)為磷脂：酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因（E2.3.1.158）、MGLL和酒精脫氫酶基因（AKR1AI）均上調(diào)和下調(diào)。這些基因共同作用降低低蠟突變無蠟細(xì)胞中TG的含量。
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