在三代測序技術(shù)創(chuàng)新開發(fā)方面，百邁客基于PacBio的Sequel Ⅱ平臺，通過實驗研發(fā)，在確保有高準確度和長讀長優(yōu)勢的同時，大大提高了數(shù)據(jù)利用率，降低了成本。該產(chǎn)品迄今為止已參與研究近千個項目，成功開發(fā)近10萬份樣本，極大地促進了全長微生物多樣性測序技術(shù)在微生物組科研領(lǐng)域內(nèi)的普及。
近日，百邁客客戶文章不斷，喜報頻頻，在恭喜老師論文發(fā)表的同時，我們對文章進行了解讀，分享給各位讀者，本期分享的為兩篇全長微生物多樣性在小鼠腸道菌群研究的成功案例，希望能夠為各位老師提供研究思路。
成功案例一：PacBio全長微生物多樣性測序+代謝組學+細胞因子網(wǎng)絡(luò)
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
影響因子：6.291
近日，首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院和環(huán)境毒理學北京重點實驗室在《Ecotoxicology and Environmental Safety》發(fā)表題為“Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage”的研究論文，該論文通過PacBio全長微生物多樣性測序，代謝組學和細胞因子網(wǎng)絡(luò)等方法，研究了苯所致造血毒性小鼠腸道菌群、代謝和細胞因子的關(guān)鍵特征，為闡明苯致造血毒性的可能機制提供了新的思路。
研究背景
苯是一種普遍存在的環(huán)境和工業(yè)化學物質(zhì)，被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC 1982)列為第一類致癌物, 此前的研究已經(jīng)證實，苯會導(dǎo)致各種與血液毒性相關(guān)的不良反應(yīng)，包括全血細胞減少、骨髓增生異常綜合征、再生障礙性貧血，甚至急性髓系白血病。炎癥可能參與了苯誘導(dǎo)的造血毒性，但腸道菌群、代謝紊亂和炎癥與苯誘導(dǎo)的造血毒性的系統(tǒng)證據(jù)尚未報道。因此，本研究旨在(1)分析苯暴露30天后小鼠外周血細胞計數(shù)和造血干細胞的變化;(2)觀察苯暴露30天后小鼠腸道菌群、代謝產(chǎn)物及細胞因子的變化;(3)探討腸道菌群、代謝特征及細胞因子與造血損傷的關(guān)系。該研究初步揭示了苯致造血損傷的腸道菌群、代謝和細胞因子特征，為探討苯致造血損傷的潛在機制提供了新的思路。
研究方法
試驗對象：
6周齡雄性小鼠24只，隨機分為4組(每組6只)，每周皮下注射玉米油 (對照組)或5 mg/kg、25 mg/kg、125 mg/kg油苯混合物
檢測方法：
盲腸內(nèi)容物16s rRNA基因測序；
血漿樣本UPLC-MS/MS檢測；
白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和血小板(PLT)水平測定；
相對臟器重量測定；
流式細胞分選；
組織病理學評估；
測序平臺：
Pacbio sequel II
研究結(jié)果
1.苯暴露后體重和相對臟器重量的變化
選用有白血病傾向的C57BL/6J小鼠，分別給予苯0.5 mg/kg、25 mg/kg、125 mg/kg劑量處理30天，建立苯致小鼠造血損傷模型。與對照組相比，暴露于苯的小鼠體重增加較慢，從第三周開始，各組之間有顯著差異。用相對臟器重量評價苯暴露對小鼠肝、肺、心、腎、脾和胸腺的影響。發(fā)現(xiàn)苯暴露30天后，苯暴露小鼠的肝臟重量增加，并伴隨著胸腺重量的降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖1C和H)。肺、心、腎、脾的相對臟器重量無顯著差異(圖1D-G)。
圖1. 暴露30天后苯對小鼠的總體毒性(每組n=6)。
2.苯暴露對血液系統(tǒng)的損害
骨髓是苯暴露的主要靶器官，含有大量的造血干細胞。所有成熟的血細胞通常來源于造血干細胞( HSCs)。暴露于苯的小鼠股骨切片的H&E染色顯示出造血損傷的跡象。苯暴露小鼠骨髓中有核細胞密度明顯降低，主要表現(xiàn)為髓系造血細胞(WBC、RBC、巨核細胞和粒細胞)減少，細胞間隙增大，脂肪滴積聚，細胞腫脹。這些病理改變在125mg /kg苯組小鼠中更明顯，而在對照組中則不明顯(圖2A)。為進一步研究苯暴露對造血細胞生長和自我更新的影響，采用流式細胞術(shù)定量檢測造血干細胞LSK、多能祖細胞(MPPs)、長期造血干細胞(LT-HSCs)和短期造血干細胞（ST- HSCs）。這一結(jié)果表明，與對照組小鼠相比，接觸苯后LSK和MPPs降低，而 LT-HSCs和ST- HSCs增加(圖2B-E)。苯中毒是惡性腫瘤發(fā)生前的一種表現(xiàn)，其特征是全血細胞計數(shù)顯著減少。該研究中，125 mg /kg苯組WBC、RBC、HGB和PLT水平顯著降低(P<0.05)(圖2F-I)。綜上所述，LSK比5 mg/kg和25 mg/kg苯暴露組的血液學變化更敏感，表明LSK可能是對造血損傷反應(yīng)的敏感指標。125 mg/kg苯暴露后，血液系統(tǒng)發(fā)生明顯變化，并形成苯毒性模型。
圖2.苯對小鼠造血系統(tǒng)的影響
3. 苯暴露小鼠腸道菌群失調(diào)
采集的新鮮盲腸內(nèi)容物進行16S rRNA基因測序分析，結(jié)果表明，各組的Shannon曲線趨于飽和，表明測序數(shù)據(jù)的數(shù)量和深度足以反映大部分微生物信息(圖3A)。在Venn圖中顯示了四組中共有和特有的OTUs(圖3B)。在本研究中，433個OTU中有307個是所有組共有的。接觸苯組和對照組之間的alpha多樣性并沒有導(dǎo)致微生物群落的差異(圖3C)。值得注意的是，beta多樣性結(jié)果顯示，暴露苯組和對照組的植物區(qū)系組成和分布有顯著差異(圖3D)。通過LEfSe分析，在暴露于苯的小鼠和對照小鼠盲腸內(nèi)容物中共鑒定出8個腸道微生物群，這些差異微生物群的相對豐度主要反映在屬和種水平上的變化(圖3E-F)。在屬水平，與對照相比，125 mg/kg苯暴露組中Ruminiclostridium, Desulfovibrio 和 Family_-XIII_AD3011_group，5 mg/kg苯暴露組的Oscil-libacter相對豐度顯著提高;而GCA-900066225和Candidatus_stoquefichus的豐度則顯著降低(圖4G)。在種水平，25 mg/kg苯暴露組Bacteroides_sartorii的豐度高于對照組，Anaerotruncus_sp的豐度呈相反的趨勢(圖4H)。
圖3.苯暴露小鼠盲腸內(nèi)容物腸道菌群分析(每組n=6)
4.苯暴露小鼠的代謝紊亂
使用絕對定量代謝組學研究了苯暴露30天后血漿代謝物的差異變化。如圖4A所示，成功建立了PLS-DA模型，相似樣本聚集顯著。同時，分別用PLS-DA和Mann-Whitney U檢驗計算VIP值和P值。采用UPLC-MS/MS共鑒定了209種血漿代謝物，15種不同代謝物。在VIP>1和P<0.05閾值下，苯暴露小鼠與對照組之間的潛在生物標記物為羥基苯基乳酸)，這些代謝物主要來自有機酸、脂肪酸、氨基酸、苯甲酸、肉堿、吲哚和苯丙酸(圖4B和表S2)。15種不同代謝物的劑量效應(yīng)關(guān)系如圖4C所示。
圖4.苯對小鼠造血系統(tǒng)的影響(每組n=6)
(A)采用偏最小二乘判別分析plot (PLS-DA)實現(xiàn)樣本類別的預(yù)測。(B-C)鑒別和定量差異代謝物
5. 苯暴露對血漿細胞因子的影響
為了了解細胞因子網(wǎng)絡(luò)在苯誘導(dǎo)的造血損傷中的作用，采用Luminex技術(shù)同時檢測小鼠血漿中的23種細胞因子。結(jié)果表明，與對照組相比，只發(fā)現(xiàn)5 mg/kg組IL-5升高，而在25 mg/kg組中，除IL-5外，Eotaxin也發(fā)生了顯著改變。隨著苯暴露水平的升高，125 mg/kg苯暴露組IL-4、IL-5、IL-10、Eotaxin、MIP-1α和MIP-1β水平顯著升高(表1)。
表一.測定不同劑量苯暴露組和對照組23種血漿細胞因子水平
6.腸道微生物群、代謝產(chǎn)物和細胞因子與造血損傷的相關(guān)性
為探討不同腸道菌群、不同代謝產(chǎn)物、不同細胞因子與造血損傷的關(guān)系，研究者采用Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明，造血損傷與Ruminiclostridium、Family_XIII_AD3011_group、Bacteroides_sartorii、Anaerotruncus_sp、GCA-900066225和Candidatus_stoquefichus有關(guān)，而與Desulfovibrio和Oscillibacter無相關(guān)性(圖5A)。篩選得到12種與造血損傷相關(guān)的血漿代謝物，包括2-羥基-2-甲基丁酸、戊二酸、羥丙酸、2,2-二甲基琥珀酸、己二酸、甲基戊二酸、DPA、4-羥脯氨酸、β -丙氨酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酰肉堿和羥基苯基乳酸(圖5B)。篩選的差異細胞因子均與造血損傷相關(guān)，其中IL-5、IL-10和MIP-1α與造血損傷密切相關(guān)(圖5C)。這些結(jié)果表明腸道菌群、代謝和細胞因子可能參與了苯誘導(dǎo)的造血損傷過程。
圖5.腸道微生物群、代謝產(chǎn)物和細胞因子與造血損傷的相關(guān)性。
(A) 不同腸道菌群與造血損傷的相關(guān)性。(B)差異代謝物與造血損傷的相關(guān)性。(C)不同細胞因子與造血損傷的相關(guān)性。* P < 0.05。
前人文獻表明TH2細胞分泌和產(chǎn)生了上調(diào)的細胞因子(如IL-4、IL-5和IL-10)，并在機體中發(fā)揮重要的免疫作用。IL-5在苯暴露組和對照組表現(xiàn)出顯著的劑量-反應(yīng)關(guān)系，與造血損傷呈極顯著負相關(guān)。分析表明與IL-5與Family_XIII_AD3011_group呈顯著負相關(guān)，與Anaerotruncus_sp呈正相關(guān)(圖6A)。此外，羥丙酸和己二酸與IL-5呈負相關(guān)，而4-羥脯氨酸與IL-5呈正相關(guān)(圖6B)，F(xiàn)amily_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp的豐度變化分別與己二酸和4-羥脯氨酸呈顯著負相關(guān)。綜上所述，F(xiàn)amily_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp可能調(diào)節(jié)了已二酸和4-羥脯氨酸的產(chǎn)生水平，這些代謝產(chǎn)物進一步激活TH2細胞大量分泌IL-5，引起促炎反應(yīng)或免疫紊亂(圖6D)。這可能是苯誘導(dǎo)造血毒性的初步潛在機制，有待進一步研究證實。
圖6.腸道菌群、代謝產(chǎn)物和細胞因子與IL-5的相關(guān)性
(A)腸道差異菌群與IL-5的相關(guān)性。(B)差異代謝物與IL-5的相關(guān)性。(C)差異腸道菌群與差異代謝產(chǎn)物的相關(guān)性。(D)在苯誘導(dǎo)的血液毒性中可能涉及腸道微生物群、代謝產(chǎn)物和細胞因子的信號通路
研究結(jié)論
苯暴露30天后，小鼠的造血功能受損，在5 mg/kg (1.43 ppm)苯暴露水平下，造血干細胞優(yōu)先改變于外周血細胞。在低苯暴露水平下，造血干細胞的改變可能是一個更敏感的指標。此外，作者系統(tǒng)地分析了苯誘導(dǎo)造血毒性過程中腸道菌群、代謝和細胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系，并提出了一些有意義的指標，包括2種腸道微生物(Family_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp)，2種血漿代謝物(己二酸和4-羥脯氨酸)和促炎細胞因子IL-5。研究結(jié)果為腸道菌群-代謝-炎癥在苯誘導(dǎo)的造血損傷中的作用提供了新的見解，未來需要通過功能研究進一步探索。
成功案例二：PacBio全長微生物多樣性測序+qPCR+功能預(yù)測
期刊：Food&Function
影響因子：5.396
近日，百邁客與華南生物醫(yī)學研究中心，福建師范大學合作，在《Food&Function》發(fā)表題“Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model”的研究論文，通過注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥建立小鼠模型，再利用PacBio全長微生物多樣性測序，RT-qPCR檢測，ELISA試劑盒檢測等方法，研究了康普茶對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠膿毒癥及小鼠腸道微生態(tài)的保護作用，證實了康普茶作為一種新型抗炎藥物的潛力。
研究背景
康普茶是一種傳統(tǒng)且流行的發(fā)酵茶飲料，攝入康普茶對身體有益處。LPS常被用于腹腔注射建立膿毒癥模型，膿毒癥是一種危及生命的疾病，能引起全身炎癥反應(yīng)、免疫紊亂和多器官功能紊亂?？灯詹枋欠衲軐δ摱景Y有預(yù)防作用？康普茶作用機制是怎樣？這些問題是本篇文章要核心解決的問題，此次研究的結(jié)果為康普茶在預(yù)防膿毒癥的潛在作用提供了證據(jù)，對膿毒癥防治具有重要意義。
研究方法
實驗對象：
特定無菌C57BL/L的成年小鼠，隨機分為6組：①Sham（注射磷酸緩沖鹽水，自由喝水），②FD（注射磷酸緩沖鹽水，自由喝康普茶），③IA（注射磷酸緩沖鹽水，康普茶灌胃100 μL/100g，每天），④LPS（注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥，自由喝水），⑤FD+LPS（注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥，自由喝康普茶），⑥IA+LPS（注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥，康普茶灌胃100 μL/100g，每天）。
檢測方法：
①測定自制康普茶各項指標：還原糖、總多酚、有機酸、葡萄糖酸等；
②小鼠生理狀況檢測：監(jiān)控體重、直腸溫度、紅細胞，白細胞計數(shù)、淋巴細胞等生理指標，并記錄小鼠死亡率；術(shù)后6h后，收集小鼠血液供下一步分析；
③分子檢測：肺組織采用RT-qPCR檢測，ELISA試劑盒檢測小鼠血樣炎癥因子，小鼠糞便使用全長微生物多樣性分析（n=60），蛋白印跡分析。
測序平臺：
PacBio Sequel II（百邁客，同時使用BMK Cloud進行生物信息分析）
研究結(jié)果
1.康普茶成分、小鼠模型及其生理功效
康普茶含有的成分，且康普茶對血液系統(tǒng)未造成任何損害。LPS組小鼠體征下降，其他五組小鼠體征相近；LPS組小鼠直腸溫度下降，F(xiàn)D+LPS、IA+LPS組小鼠直腸溫度下降后回升至正常值；康普茶使注射LPS的小鼠存活率上升。
2. 康普茶對LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的影響
康普茶攝入降低LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠炎癥因子水平、免疫細胞亞群水平?？灯詹钄z入改變LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠細胞因子的mRNA水平，肺組織病理學特征，康普茶攝入顯著降低了LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的肺部組織損傷程度?？灯詹璧臄z入可以抑制LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的NF-κB激活。
圖1.A~F：六組小鼠肺部組織H&E染色顯微鏡圖片，G：六組小鼠肺部損傷的量化評分
3. 康普茶對小鼠腸道微生物的影響
①組成分布分析
康普茶攝入對小鼠腸道微生物門水平分布產(chǎn)生了影響，不同組小鼠的腸道微生物群不同：在Sham組，乳酸桿菌屬為生物標志物；在IA組中，彎曲桿菌屬、法克蘭菌屬、瘤胃球菌科和脫硫弧菌屬是生物標志物；在FD組中，普雷沃氏菌科屬和未培養(yǎng)的細菌屬為生物標志物。異種桿菌屬是LPS組的生物標志物，F(xiàn)D+LPS組是幽門螺桿菌、白桿菌和真桿菌，杜博西菌和念糖菌是IA+LPS組的生物標志物。
圖2.六組小鼠腸道微生物組成分布分析
②相關(guān)性分析
計算6組間差異，評價IL-1β、IL-6、TNF-α和HE評分對微生物群組合的影響。去鐵桿菌門與IL-6、IL-1β、TNF-α和HE評分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.852(p<0.001)、0<0.852(p<0.001)、0.843(p<0.001)和0.852(p<0.001)。藍細菌門的豐度與IL-6(r=0.523，p<0.05)和TNF-α(r=0.520，p<0.05)呈負相關(guān)。在屬水平上，幽門螺桿菌與IL-6、IL-1β、TNF-α和HE評分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.816(p<0.001)、0.776(p<0.001)、0.749(p<0.001)和0.635(p<0.01)。12B)。蛛網(wǎng)膜梭狀芽孢桿菌與IL-1β、IL-6和TNF-α也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.700(p<0.01)、0.515(p<0.05)和0.509(p<0.05)。而腐爛別樣桿菌與IL-6和TNF-α呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.482(p<0.05)和0.517(p<0.05)。
圖3.六組小鼠腸道微生物熱圖分析（A.門水平，B.屬水平）
③PICRUSt分析
預(yù)測IA和IA+LPS組的功能基因，1343條顯著差異通路，其中“全局和概述”、“碳水化合物代謝”、“氨基酸代謝”、“能量代謝”、“輔助因子和維生素代謝”、“膜運輸”、“核苷酸代謝”、“翻譯”、“復(fù)制修復(fù)”、“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”的平均比例高，且都是顯著代謝途徑（p<0.05）。
圖4.PICRUSt功能預(yù)測分析
研究結(jié)論
康普茶可有效預(yù)防膿毒癥初期小鼠的細胞免疫功能紊亂，并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，補充康普茶改變了腸道微生物群的多樣性，促進了丁酸鹽產(chǎn)生細菌的生長，發(fā)揮抗炎作用。
總結(jié)
通過以上兩篇文章，我們可以發(fā)現(xiàn)，通過腸道菌群全長微生物多樣性測序+生理生化指標測定+細胞因子檢測+代謝組學檢測等能夠較為全面的闡明生物學問題。通過對多組學數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析進而可以得到菌群與細胞因子，菌群與代謝物之間的相關(guān)性，同時運用PacBio全長微生物多樣性能夠在種水平上尋找差異的物種，進一步提升biomarker的鑒定水平。正值年末，百邁客微生物系列產(chǎn)品促銷活動火熱進行中，無論是測序還是分析，價格優(yōu)惠，歡迎垂詢~
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參考文獻：
1.Zhang L, Jing J, Han L, et al. Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 228: 112956.
2.Wang P, Feng Z, Sang X, et al. Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model[J]. Food & Function, 2021, 12(20): 10263-10280.
京公網(wǎng)安備 11011302003368號