BSA（Bulked Segregant Analysis），又稱集群分離分析法或混合分組分析法，針對(duì)目標(biāo)性狀，選擇表型極端差異的親本構(gòu)建家系，同時(shí)對(duì)兩親本和該家系目標(biāo)性狀表型極端的子代分別混合得到的兩個(gè)混池進(jìn)行全基因組重測(cè)序，檢測(cè)到的兩混池間DNA差異片段即為候選區(qū)域，并注釋該區(qū)域基因，可進(jìn)一步定位到目標(biāo)性狀相關(guān)的基因或標(biāo)記。利用該方法，可以快速的對(duì)單一性狀在基因組上進(jìn)行定位。
隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起，基于全基因組測(cè)序的BSA方法廣泛地應(yīng)用在作物、蔬菜、花卉等物種中，并且成功定位出了許多農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因。BSA因其具有“快速、準(zhǔn)確、性價(jià)比高”的優(yōu)點(diǎn)，受到了廣大育種家的青睞。
下面小編為大家分享幾篇BSA文章案例，一起來看下BSA分析的應(yīng)用思路～
案例分享
基于BSA和轉(zhuǎn)錄組水稻孕穗期耐寒性候選基因鑒定
研究背景
水稻是全世界最重要的糧食作物之一，同時(shí)也是冷敏感作物。孕穗期冷害是影響水稻穗部形態(tài)建成和制約水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一。黑龍江省位于中國(guó)最北端，是中國(guó)的水稻主產(chǎn)區(qū)。低溫脅迫，特別是孕穗期，嚴(yán)重影響了黑龍江省水稻總產(chǎn)量。因此，水稻抗寒育種是黑龍江省水稻增產(chǎn)的重要策略。由于水稻孕穗期耐冷性遺傳機(jī)制的復(fù)雜性和傳統(tǒng)QTL定位方法的局限性。從而導(dǎo)致耐冷遺傳研究較為緩慢。因此，發(fā)掘孕穗期耐冷主效QTL是挖掘耐冷基因的基礎(chǔ)，同時(shí)，對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇在耐冷品種的選育上具有重要指導(dǎo)作用。
研究思路
研究結(jié)果
BSA分析
本研究在Longjiang25（耐冷）和Longjiang11（不耐冷）雜交構(gòu)建的F2群體中（245份材料），挑選50個(gè)耐冷和50個(gè)不耐冷極端材料分別進(jìn)行混池測(cè)序，親本各10×，子代分別是67×和80×，進(jìn)行BSA分析；利用SNP index 和indel index方法進(jìn)行性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)，最終將候選區(qū)域定位到6號(hào)染色體和9號(hào)染色體上的0.82Mb區(qū)域內(nèi)，分析發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域共包含98個(gè)注釋基因。
圖1 BSA定位結(jié)果
轉(zhuǎn)錄組分析
作者對(duì)低溫脅迫（12℃）條件下，對(duì)第0、2、4天水稻花序上3.5-4.5mm的幼穗進(jìn)行取樣， 做 RNA-seq分析 ，分析兩親本在低溫脅迫條件下，差異基因表達(dá)情況。結(jié)合BSA關(guān)聯(lián)分析的定位區(qū)間，發(fā)現(xiàn)候選區(qū)域內(nèi)有50個(gè)差異表達(dá)基因。通過對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集功能分析結(jié)合功能富集分析，確定4個(gè)（Os09g0514200、Os09g0516500、Os09g0516600和Os09g0511600）潛在候選基因與耐寒性相關(guān)；進(jìn)一步通過qRT-PCR驗(yàn)證這4個(gè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)一致。
圖2 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果
總結(jié)
本研究中對(duì)水稻耐冷材料和不耐冷材料構(gòu)建 F2 群體，選擇兩個(gè)極端混池進(jìn)行全基因組混池測(cè)序，同時(shí)該研究結(jié)合 RNA-seq和基因功能富集分析，確定4個(gè)與耐寒性相關(guān)的潛在候選基因。
基于高密度遺傳圖譜和BSA共定位油菜株高相關(guān)的候選基因
研究背景
油菜是世界上最重要的油料作物之一，株高是油菜株型的主要決定因素之一，不但與油菜收獲指數(shù)以及產(chǎn)量密切相關(guān)，而且也是影響抗倒伏能力和機(jī)械化收獲特性的一個(gè)重要因素。因此，解析油菜株高遺傳結(jié)構(gòu)，挖掘矮稈種質(zhì)資源和矮稈基因?qū)χ参镏晷偷母牧己团嘤筒死硐胫晷推贩N具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。
研究思路
研究結(jié)果
BSA分析
本研究在ZS11-HP（高）×sdw-e（矮，自然變異）構(gòu)建的F2群體中，分別挑選20株極高和極矮的材料進(jìn)行混池構(gòu)建，進(jìn)行重測(cè)序，親本測(cè)序深度為69.96×和69.62×，子代測(cè)序深度為32.82×和33.47×，進(jìn)行BSA分析，通過SNP-index的方法定位到A10染色體上0 Mb-5.5 Mb, 6.0 Mb-12.0 Mb（11.5Mb大小）的顯著區(qū)間。
圖1 BSA分析結(jié)果
高密度遺傳圖譜構(gòu)建與QTL分析
用于高密度遺傳圖譜構(gòu)建的群體是同一個(gè)親本構(gòu)建的包含200份單株的F2群體，對(duì)子代測(cè)序7.67×，依據(jù)基因型開發(fā)出4323個(gè)bin標(biāo)記，利用Highmap構(gòu)建了油菜的19條連鎖群，總遺傳距離為2026.52cM；又利用R/qtl的區(qū)間作圖法（IM）和復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM）定位油菜株高性狀的QTL位點(diǎn)，定位到3個(gè)主效QTL，其中qPHA10與BSA定位結(jié)果高度一致，顯示出定位的可靠性。
圖2 油菜高密度遺傳圖譜
圖3 基于 IM和CIM的QTL定位結(jié)果
轉(zhuǎn)錄組分析
為了進(jìn)一步挖掘候選基因，本研究進(jìn)行了ZS11-HP和sdw-e中SAM組織的轉(zhuǎn)錄組分析。根據(jù)定位的QTL區(qū)間，在穩(wěn)定的QTL的區(qū)間內(nèi)共鑒定出11個(gè)上調(diào)和14個(gè)下調(diào)的候選基因。進(jìn)一步基于兩個(gè)親本的變異信息和RNA-seq，確定BnaA10g08290D、BnaA10g09290D和BnaA10g08230D可能是本研究的候選基因。后續(xù)又結(jié)合qRT-PCR分析，驗(yàn)證了差異基因表達(dá)。
圖4 RNA-seq分析和差異表達(dá)基因KEGG富集分析
總結(jié)
本研究中基于兩個(gè)F2群體分別進(jìn)行BSA分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建，采用BSA和遺傳圖譜共定位的方法對(duì)油菜株高相關(guān)的QTL進(jìn)行定位，在兩個(gè)F2群體中定位到油菜株高相關(guān)的主效QTL qPHA10。
基于BSA和GWAS分析揭示大豆花葉病毒G2和G3株的抗性機(jī)制
研究背景
大豆是重要油料作物，生長(zhǎng)發(fā)育過程受各種不利環(huán)境及病蟲害影響。大豆花葉病毒病是多數(shù)由大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）侵染引起的病毒性病害，全球范圍內(nèi)分布較廣、具有破壞性的病毒性疾病之一，其對(duì)大豆植株危害嚴(yán)重，傳播范圍廣。挖掘抗病基因、培育抗病品種是抵抗病害和保證大豆產(chǎn)量的有效途徑。
研究思路
研究結(jié)果
GWAS分析大豆對(duì)SMV菌株G2的抗性
本研究對(duì)352份栽培大豆種質(zhì)材料進(jìn)行SLAF測(cè)序，共開發(fā)出26,143 SNPs標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在13號(hào)染色體上鑒定到與SMV菌株G2抗性相關(guān)的顯著SNP位點(diǎn)，其中SNP rs29384570解釋了16.58％的表型變異；作者將與rs29384570（Chr. 13: 29384570 bp）相關(guān)的區(qū)域確定為SMV抗性的主要基因座，命名為Rsvg2。
連鎖分析
為了進(jìn)一步驗(yàn)證Rsvg2的準(zhǔn)確性，作者基于130份RIL群體材料構(gòu)建極端混池，采用SLAF-seq與BSA分析結(jié)合的策略，進(jìn)行BSA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與SMV抗性相關(guān)基因組簇分布在13號(hào)染色體上的3個(gè)相鄰基因區(qū)域（28Mb-32Mb）；第2個(gè)區(qū)域與GWAS關(guān)聯(lián)的區(qū)域重疊，表明Rsvg2是一個(gè)穩(wěn)定的位點(diǎn)，可以潛在控制大豆對(duì)SMV G2和G3的抗性，并且抗性基因更可能在第2個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域。利用基于130個(gè)RIL群體材料中的40個(gè)多態(tài)SSR和SNP標(biāo)記的連鎖圖，進(jìn)一步將Rsvg2基因座定位在SNP 9和SNP 11之間的區(qū)間中，該區(qū)間包含30個(gè)候選基因。
接著，作者又利用一個(gè)超大F2分離群體，在Rsvg2的間區(qū)和側(cè)翼區(qū)，利用55個(gè)具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記與F2中抗性植株的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將Rsvg2定位至2.83 kb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間包含一個(gè)編碼SOT（磺基轉(zhuǎn)移酶）的GmST1基因。作者將GmST1確定為Rsvg2位點(diǎn)的候選基因。
圖1 Rsvg2的精細(xì)定位
轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證
作者進(jìn)一步通過表達(dá)分析、遺傳轉(zhuǎn)化分析等方法驗(yàn)證GmST1基因?qū)Υ蠖够ㄈ~病毒的抗性，通過qRT-PCR和RNA-seq對(duì)SMV抗性株系Dongnong93-046和SMV-感性株系Hefeng25的不同組織進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，GmST1基因受SMV感染調(diào)控，且該基因在抗SMV和易感SMV大豆品種之間存在差異表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GmST1的RSVG2-R等位基因提升了大豆對(duì)SMV G2和G3菌株的抗性。最終發(fā)現(xiàn)編碼磺基轉(zhuǎn)移酶的GmST1基因, 賦予大豆對(duì)大豆花葉病毒G2和G3株的抗性。
圖2 GmST1基因在不同抗性材料中的相對(duì)表達(dá)量
圖3 轉(zhuǎn)基因植株表型
總結(jié)
本研究結(jié)合GWAS，BSA，QTLs等群體基因定位研究方法，對(duì)大豆植株對(duì)大豆花葉病毒G2和G3株的抗性基因座進(jìn)行精細(xì)定位，進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組等方法進(jìn)行驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)GmST1基因, 其編碼磺基轉(zhuǎn)移酶, 賦予大豆對(duì)大豆花葉病毒G2和G3株的抗性。
尾聲
通過以上文獻(xiàn)我們可以看出BSA在遺傳群體基因定位中發(fā)揮重要作用，可通過BSA分析對(duì)極端性狀進(jìn)化基因定位，進(jìn)一步與遺傳定位結(jié)果進(jìn)行互相驗(yàn)證。然而，為了能讓廣大科研工作者能夠自主便捷的通過BSA進(jìn)行相關(guān)材料的群體遺傳學(xué)研究，百邁客云自上線以來，百邁客群體研發(fā)團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步全情打造群體云分析平臺(tái)，耗時(shí)一年半時(shí)間重磅推出的BSA云分析平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)極速標(biāo)準(zhǔn)分析、個(gè)性化分析、實(shí)時(shí)查看的優(yōu)勢(shì)，另外還可大大降低數(shù)據(jù)分析成本，讓科研更加高效！
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參考文獻(xiàn)
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