Nanopore全長轉(zhuǎn)錄組由于其長讀長、低堿基偏好性，同時完成基因水平及轉(zhuǎn)錄本水平定量的高性價比的優(yōu)勢，越來越多的應(yīng)用于新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)、可變剪接發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)錄本水平定量等方向的研究，目前已經(jīng)產(chǎn)出多篇高分文章。今天和大家一起分享一篇Nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域上應(yīng)用研究的文章。
英文題目：Full-length transcriptome analysis reveals the mechanism of acupuncture at PC6 improves cardiac function in myocardial ischemia model
發(fā)表期刊：Chinese Medicine
影響因子：5.455
發(fā)表單位：成都中醫(yī)藥大學(xué)
原文鏈接：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34238326
研究背景
心肌缺血(MI)是一種嚴(yán)重的心血管疾病，具有高發(fā)病率和死亡率的特點(diǎn)。心肌缺血的病理過程非常復(fù)雜。針刺內(nèi)觀穴（PC6）已被證實對心肌梗死有效，但其機(jī)制尚不清楚。本研究通過全長轉(zhuǎn)錄組研究了針刺對心肌梗死影響的機(jī)制，本研究將有助于為心肌梗死尋找新的治療靶點(diǎn)，為針刺研究提供獨(dú)特的視角。
材料方法
成年雄性C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對照組、MI組和PC6組。MI組小鼠為通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)形成MI模型，PC6組在造模完成后，針刺內(nèi)關(guān)穴治療5天后取材。經(jīng)胸超聲心動圖評估MI手術(shù)前后小鼠心功能情況，并進(jìn)行血清心肌酶和炎癥細(xì)胞因子的測定，之后三組樣本各取3個重復(fù)，共9個樣本進(jìn)行ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序。
主要結(jié)果
一、針刺PC6穴位可有效保護(hù)心肌免受MI損傷
為了探討針刺PC6穴對心肌損傷的影響，作者首先評估了心功能和梗死面積。超聲心動圖結(jié)果顯示MI組的EF（ejection fraction）和FS（fractional shortening）均較對照組明顯降低。PC6穴位治療后，EF和FS均增加。針刺治療5天后, 采用TTC染色檢測梗死面積。結(jié)果顯示，針刺治療顯著減小心肌損傷的大小。采用ELISA法測定反映急性心肌損傷的心肌特異性血清酶，包括心肌肌鈣蛋白T (cTnT)和心肌肌鈣蛋白I (cTnI)的水平。結(jié)果表明，心肌梗死術(shù)后cTnT和cTnI水平升高，針刺可顯著降低血清酶水平。
二、針刺PC6穴位廣泛改變基因表達(dá)
為了探討針刺治療心肌梗死的機(jī)制，作者利用納米孔完成了不同組的基因表達(dá)檢測。RNA-seq結(jié)果顯示，與對照組相比，MI組有5083個差異表達(dá)基因，PC6組與MI組相比有324個差異表達(dá)基因。通過聚類分析將對照組、MI組和PC6組中上調(diào)和下調(diào)基因制作熱圖和維恩圖，發(fā)現(xiàn)MI組2773個差異基因上調(diào)，針刺治療下調(diào)了其中的65個差異基因，同時，在MI組的2308個下調(diào)的差異基因中，針刺治療可逆轉(zhuǎn)19個差異基因的表達(dá)。作者推測這84個差異基因可能是針刺抗心肌缺血作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)?；赟TRING數(shù)據(jù)庫對MI和PC6共同調(diào)控的差異基因進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)主要富集了4類，主要包括：炎癥反應(yīng)，肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，I型干擾素介導(dǎo)的信號通路，以及RNA聚合酶II基因DNA在核外周的轉(zhuǎn)錄依賴鏈。
三、炎癥反應(yīng)的驗證
差異基因主要富集在炎癥反應(yīng)信號通路中，通過HE染色顯示MI組炎性細(xì)胞大量積聚，針刺可明顯減少炎性細(xì)胞浸潤。檢測血清中炎性細(xì)胞因子的水平顯示MI組血清TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IL-1β(白細(xì)胞介素-1β)、IL-6(白細(xì)胞介素-6)水平較對照組升高，針刺可降低這些炎性細(xì)胞因子水平，并通過PCR進(jìn)行了驗證。
四、整合心肌缺血的可變剪接事件
已有研究報道可變剪接（AS）參與心肌缺血的發(fā)生發(fā)展。作者在每組中發(fā)現(xiàn)了大量的AS。在所有RNA-seq檢測的樣本中，共發(fā)現(xiàn)與1994個基因相關(guān)的8237個AS事件。并對不同類型的可變剪接時間進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果表明，一個基因可能發(fā)生多種類型的mRNA剪接事件;部分基因可能有3種AS類型表達(dá)，半數(shù)以上的AS事件是ES類型的事件。差異表達(dá)基因和AS事件相關(guān)基因分析結(jié)果顯示許多差異基因經(jīng)歷了AS事件，表明許多基因可能在MI的病理過程和針刺選擇性剪接治療中發(fā)揮作用。KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)AS相關(guān)基因主要富集在線粒體組織、蛋白酶體蛋白分解代謝過程、RNA剪接、通過剪接體剪接mRNA以及代謝過程等途徑。
五、心肌缺血的差異選擇性剪接事件分析
差異AS分析結(jié)果顯示，本研究共鑒定出347個差異AS事件，其中上調(diào)174個，下調(diào)173個。AS上調(diào)事件數(shù)量與AS下調(diào)事件數(shù)量相同。與對照組相比，MI組有129例AS事件差異上調(diào)，147例AS事件差異下調(diào)。與MI組相比，PC6組有45個AS事件差異上調(diào)，26個AS事件差異下調(diào)。通過GO和KEGG富集分析，作者發(fā)現(xiàn)這些基因富集的前10個通路包括核糖體、HIF-1信號通路、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病。結(jié)果表明，這些參與差異AS事件的基因與心臟病有關(guān)。
六、在全長轉(zhuǎn)錄組中檢測到的新基因的分析
全長轉(zhuǎn)錄組可以準(zhǔn)確識別轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)從而鑒定新轉(zhuǎn)錄本。本研究中一共鑒定到了602個新基因。這些新基因大部分為9個樣本共享，說明這些新基因可以在所有樣本中穩(wěn)定表達(dá)。也有一些新的基因僅在MI組和PC6組表達(dá)，說明在病理條件下這些基因表達(dá)模式發(fā)生了變化（圖B)。對照組新基因表達(dá)模式與MI組和PC6組差異顯著;而MI組與PC6組有相似的新基因表達(dá)模式。維恩圖分析差異新基因的重疊部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MI組3個上調(diào)基因在針刺后下調(diào)，只有1個下調(diào)的新基因通過針刺表達(dá)上調(diào)。
總結(jié)
作者證明針刺PC6可以改善心功能，減少梗死損傷。通過ONT全長轉(zhuǎn)錄組準(zhǔn)確的鑒定出的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)信息，作者發(fā)現(xiàn)針刺可以調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因和可變剪接，并預(yù)測這可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。作者還檢測到針刺治療后表達(dá)發(fā)生變化的4個新的基因，這些基因可能是針刺治療心肌梗死的靶點(diǎn)?；谶@些結(jié)果，作者得到針刺治療心肌缺血可能是通過轉(zhuǎn)錄組的多方面調(diào)控的結(jié)論。
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