什么是RT-qPCR？& RNA一站式解決方案

什么是RT-qPCR？& RNA一站式解決方案

RT-qPCR包括三大步驟：RNA的提取與質量檢測、逆轉錄成cDNA、以及實時熒光定量PCR實驗。通過RT-qPCR實驗，可以合成cDNA探針、獲取目的基因、以及分析基因的轉錄水平。

RNA的提取與質量檢測

從細胞、組織等樣本中提取出RNA后，需要對提取的RNA的純度、濃度、以及完整性進行評估，質檢達標后才能進行后續(xù)的實驗。一般需要通過紫外分光光度法（Nanodrop儀器）檢測RNA的濃度和純度；Agilent 2100儀器分析RIN值檢測RNA的完整性；以及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否有基因組污染和其他雜質污染。

1.RNA的濃度&純度檢測（吸光度法）

由于RNA具有共軛結構，可以吸收紫外光，故測定RNA溶液在260 nm的吸光度值，可計算出RNA的含量。其中純度高的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀比值應在1.9~2.2之間，若比值＞2.2，表明可能有異硫氰酸，若比值<1.9，表明有蛋白質、酚等污染；建議重新提取RNA。

2.RNA完整性檢測（Agilent 2100分析）

RIN值大小反映樣品的完整性，一般RIN值在5~10之間，數(shù)值越接近10表明RNA完整性越高，反之RIN值越小完整性越差（特殊樣品需結合基線綜合評估）。Agilent 2100檢測不僅可以得到樣品RIN值，還可以得到樣品濃度以及28S/18S比值（原核生物是23S/16S）。

圖1：RNA完整性指標

3.基因組及其他雜質污染檢測（凝膠電泳）

真核生物RNA特有28S、18S、5S三條帶，進行瓊脂糖凝膠電泳分析時，28S條帶的亮度大概是18S條帶的兩倍或者以上，且無拖尾，說明RNA的完整性高、未被其他雜質污染。若出現(xiàn)其他條帶、或者條帶彌散拖尾，建議重新提取RNA。

圖2：真核生物完整的 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

總之，RNA提取的原則：

①　保證RNA一級結構的完整性；

②　不存在對酶存在抑制作用的有機溶劑，以及過高濃度的金屬離子污染；

③　其他蛋白質、多糖和脂類污染；

④　排除其他核酸分子（DNA、游離核苷酸等）污染。

產品名稱：植物RNA提取試劑盒?Biomarker Plant Total RNA Isolation Kit (Polysaccharides&Polyphenolics–rich)

目錄:?RK02004

規(guī)格:?50 RXN

產品特點：專門針對多糖多酚或高淀粉植物組織提取RNA

實驗數(shù)據(jù)：RNA提取凝膠電泳圖

圖3：提取50 mg不同組織中的RNA。Lane 1：番茄果；Lane 2：南瓜葉；Lane 3：玉米根；Lane 4：南瓜莖；Lane 5：絲瓜花；Lane 6：水稻種子。

除此之外，百邁客公司還提供動物常量RNA提取試劑盒（目錄:RK02009

規(guī)格: 50 RXN，數(shù)據(jù)查看鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/HNp3yFve6AEi3wykngJLlg），可以從細胞、動物組織、幼蟲等樣本中提取純度高的RNA。

以及微量細胞組織RNA提取試劑盒（目錄:? RK02010 規(guī)格:? 50 RXN，數(shù)據(jù)查看鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/5IYa1MNpQA030OnH_OSeig），可以從~5 mg的細胞、組織樣本中，快速（20 min內）提取純度高的RNA。

逆轉錄

cDNA的合成是RT-PCR的重要環(huán)節(jié)。提取完組織或細胞中的總RNA后，以其中的mRNA作為模板，利用逆轉錄酶逆轉成第一鏈cDNA，構建cDNA文庫，并從中篩選特異的目的基因。該方法已成為基因工程技術中獲得目的基因的策略之一。

逆轉錄PCR重要參數(shù)

不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同；因此，選擇合適的逆轉錄酶、二價陽離子、dNTP、引物的選擇等非常重要。具體參數(shù)如下：

1.逆轉錄酶

目前市場上有兩種不同的逆轉錄酶，一種來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的RNA酶H活性，它最適溫度是42?℃，最適pH 8.3。但是高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產生也限制其長度。

另一種來源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)的逆轉錄酶，是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNA酶H活性，最適溫度37?℃，最適pH 7.6，較弱的RNA酶H活性，可擴增2-3 kb的cDNA。

2.單價陽離子

離子條件基本上影響各種模板的轉錄效率。K⁺的轉錄產物比Na⁺較長。對于cDNA長度的最適K⁺濃度為140-150 mM。

3.二價陽離子

對于反轉錄酶活性來說，二價陽離子也是必需的。產生全長cDNA產物的最適濃度是6-10 mM。

4.dNTP

四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)的濃度，對于有效合成cDNA是至關重要的。如果其中只有一種的濃度小于10-50?μM，cDNA的產量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-500?μM。

5.引物的選擇

逆轉錄引物一般包含三種：oligo dT，Random Primer Mix和特異性引物?？蛻艨梢愿鶕?jù)個人需求進行選擇。

注意事項?

1.cDNA第一鏈合成的反應液需要冰上配制。

2.高純度、完整性好的RNA對于RT-PCR檢測至關重要。

3.Oligo-dT引物對于大多數(shù)應用是常用的，因為它確保所有cDNA拷貝終止于mRNA的3′?末端并可獲得最高產量的全長cDNA。

產品名稱：BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit

目錄:?RK02002

規(guī)格:?100 RXN

產品特點：高反轉錄酶的活性、熱穩(wěn)定性強、可擴增長達10 kb的cDNA

實驗數(shù)據(jù)：以cDNA為模板，進行PCR擴增的凝膠電泳圖

圖4：以1μl人肝癌細胞RNA為模板，用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，得到cDNA產物。再以100?ng cDNA為模板，用Biomarker HS 2× HF Master Mix進行PCR擴增，將得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果所示：擴增條帶單一且產量高。

實時熒光定量PCR

熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是通過檢測DNA雙鏈結合的染料，是 SYBR? Green I對DNA擴增過程中的起始量進行定量監(jiān)測的技術手段。qPCR實驗結果包含擴增曲線和溶解曲線。

1.擴增曲線

1）正常的擴增曲線一般呈S型、有明顯的四個時期，C_t值在20-30之間，且復孔的C_t值盡量一致，相差不要超過0.5個C_t值（上限是1個C_t值）；

2)?同一個基因在不同濃度的相同模板下擴增，其相差的C_t值為相差濃度倍數(shù)的2次方。

3)?另外陰性對照不能有擴增（40個循環(huán)以后出C_t值屬正常現(xiàn)象，也可算作沒有擴增）。

圖5：擴增曲線

2.溶解曲線

1）溶解曲線是為了驗證擴增產物特異性，一般是單峰，和模板的濃度無關。

2）一般SYBR法的目的基因在80~90?℃之間。

3）若出現(xiàn)其他峰，可能是引物二聚體導致需要優(yōu)化引物序列、引物加量等因素。

圖6：溶解曲線

注意事項

(1) 請確保引物的正確性和特異性。通常引物終濃度0.2 μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可以在0.1~1.0 μM范圍內調整引物濃度。

(2) 擴增產物的長度建議選擇在70~200 bp范圍內。

(3) 梯度稀釋模板，并依次建立標準曲線。

(4) 建議20 μL反應體系中加入1 pg~100 ng的DNA為模板，并設計無模板對照(NTC)。

(5)?為確保實驗重復性，建議每個樣品和對照組設置3個復孔。

產品名稱：Biomarker?2× SYBR Green Fast qPCR Mix

目錄: ?RK02001

規(guī)格: ?500 RXN

產品特點：兼容性完美，全平臺通用；靈敏度高，可檢測低至10 pg的模板。

實驗數(shù)據(jù)：qPCR擴增曲線

圖7：以1?μg不同物種的RNA為模板（紅色：人肝癌細胞；藍色：雞；黑色：斑馬魚；紫色：水稻種子；黃色：番茄果），用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，得到cDNA產物。再以100 ng不同物種的?cDNA為模板，用Biomarker?2×SYBR Green Fast qPCR Mix進行qPCR擴增。

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