單細胞核+空間轉(zhuǎn)錄組揭示膀胱癌免疫治療預(yù)后機制

膀胱癌患者接受免疫治療后預(yù)后效果的好壞仍然是臨床上面臨的一個主要的挑戰(zhàn)。近期NC一篇文章通過單細轉(zhuǎn)錄組及空間轉(zhuǎn)錄組闡述了對膀胱癌治療具有反應(yīng)應(yīng)答的癌細胞群。獲得了在預(yù)測對免疫治療的反應(yīng)方面更優(yōu)的marker基因。有助于為患者的治療提供更理想更優(yōu)的治療方案。

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英文題目：An N-Cadherin 2 expressing epithelial cell subpopulation predicts response to surgery,chemotherapy and immunotherapy in bladder cancer

中文題目：表達N-Cadherin 2的上皮細胞亞群預(yù)測膀胱癌對手術(shù)、化療和免疫治療的反應(yīng)

期刊：Nature Communications

IF：12.12

發(fā)表時間：2021

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34385456

摘要

術(shù)前新輔助化療（NAC）和免疫檢查點治療（ICT）已經(jīng)徹底改變了膀胱癌的治療。然而，從這些模式中獲益最多的患者分層仍然是一個主要的臨床挑戰(zhàn)。作者將人類膀胱癌的單細胞核轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組和單細胞分辨率的空間蛋白組聯(lián)合分析，確定具有治療反應(yīng)預(yù)測能力的上皮細胞亞群。這些細胞表達Cadherin12（CDH12，N-Cadherin 2?）、catenins和其他上皮細胞的標志物。CDH12富集的腫瘤可以定義患者是否接受NAC治療后預(yù)后效果差。富集CDH12的腫瘤對ICT表現(xiàn)出更好的效果。在所有情況下，通過對腫瘤CDH12富集進行患者分層比目前膀胱癌亞型能更好的預(yù)后預(yù)測。CDH12群體類似于一種未分化的狀態(tài)，具有固有的侵略性生態(tài)學，包括化學耐藥性可能是通過祖細胞樣基因表達和成纖維細胞激活介導的。CDH12富集細胞表達PD-L1和PD-L2以及耗竭T細胞共定位，可能通過CD49a（ITGA1）介導，為ICT在腫瘤中的功效提供一種解釋。總之，本研究描述了一個對膀胱癌治療具有反向應(yīng)答的癌細胞群。重要的是還為臨床標志物的篩選提供了一個令人信服的框架。

研究背景

肌肉浸潤性膀胱癌（MIBC）的分子分型改變了目前關(guān)于MIBC發(fā)病機制的概念。然而，即使是最近達成共識的分子分類系統(tǒng)也沒有為其在臨床決策中的應(yīng)用提供令人信服的證據(jù)，特別是缺乏對治療反應(yīng)的預(yù)測。利用單細胞RNA測序分析MIBC的新興研究為腫瘤內(nèi)異質(zhì)性提供了初步認識。然而，這些研究主要集中于腫瘤微環(huán)境，受限于相對較小的隊列規(guī)模，尚未提供一個更明確的治療決策途徑。在單細胞水平上的MIBC上皮和非上皮細胞的全面分析將有助于將當前的分子亞型解轉(zhuǎn)到它們的組成部分，從而開發(fā)出更有效的預(yù)后和預(yù)測工具。

材料方法

試驗材料：25例MIBC患者和4例非膀胱癌對照的尿路上皮組織

試驗方法：sn-RNAseq、空間轉(zhuǎn)錄組、TCGA數(shù)據(jù)庫bulk數(shù)據(jù)、免疫組化

研究結(jié)果

1、表達CDH12上皮細胞的鑒定

為了實現(xiàn)表征腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的第一個目標，作者首先基于sn-RNAseq細胞類型比例研究了MIBC腫瘤的總體細胞組成（圖1a）。腫瘤由約90%的上皮細胞、5%的免疫細胞、3%的成纖維細胞和2%的內(nèi)皮細胞組成，這些細胞根據(jù)相應(yīng)的角蛋白、PTPRC、膠原蛋白、PECAM1、VWF等關(guān)鍵標記基因（圖1b）。上皮間室無監(jiān)督聚類識別到了一個KRT13和KRT17差異表達的類群，KRT13、uroplakins（UPK）、KRT6A細胞周期相關(guān)基因類群，以及表達CDH12和其他上皮標記物的細胞群（圖1d）。KRT13和UPK人群是僅有的兩個缺乏來自免疫浸潤MIBC的基因標記的人群，這表明在這些人群中富集的腫瘤代表免疫“冷”腫瘤（圖1e）。進一步交叉參照傳統(tǒng)的尿上皮分化相關(guān)標記表明，KRT13和UPK群體代表一個更分化的表型，而CDH12、KRT6A和cycle群體代表一個未分化或去分化的表型（圖1f）。如預(yù)期一樣KRT13和UPK群體表達了一個上皮細胞分化網(wǎng)絡(luò)（圖1g）?；趩渭毎{(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類分析，預(yù)測CDH12群體表現(xiàn)出多種發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的高活性，包括NANOG、EOMES、PAX1和HOXD9（圖1h）。CDH12和循環(huán)群體在干-樣和神經(jīng)內(nèi)分泌基因標簽得分也高（圖1i）。

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圖1?單細胞核轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)CDH12+腫瘤細胞群

 

2、在健康正常的膀胱上皮細胞中可以發(fā)現(xiàn)富集CDH12的細胞

上皮細胞的無監(jiān)督聚類分為基礎(chǔ)、過渡和傘部類群（圖2a）。有趣的是CDH12群體與后一類典型群體明顯不同，而過渡群體的KRT13和KRT17表達水平最高（圖2b）。確定了一個始于基礎(chǔ)細胞的軌跡，隨后分化為兩種途徑：一種貫穿CDH12群體，一種跳過CDH12群體（圖2c和d）。關(guān)鍵的尿上皮分化標記物沿著這條路徑跟蹤，在起始階段CD44高表達，隨后中間是KRT13和KRT17，終點站為UPK1A、GATA3、PPARG（圖2e）。所有4個正常樣本的擬時序分析顯示出相似的路徑，CDH12群位于起始點附近（圖2f）。為了確定CDH12腫瘤細胞與正常腫瘤細胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性，并推斷它們在正常上皮細胞分化軌跡上的位置，作者使用表達相似性，確定了每個MIBC上皮細胞中最接近的正常細胞，然后給腫瘤細胞分配相應(yīng)的正常潛伏期（圖2f）。值得注意的是，最未分化表型對應(yīng)的間隔得分預(yù)測了較差的疾病特異性生存（DSS），而最分化表型對應(yīng)的間隔得分預(yù)測了較好的DSS，中間的間隔得分顯示了相反結(jié)果之間的過渡（圖2f）。

圖2 CDH12+腫瘤群體類似于早期未分化尿路上皮細胞的特征并與較差的臨床結(jié)果相關(guān)

 

3、CDH12評分預(yù)測MIBC患者不良預(yù)后

? ? ? ?作者對TCGA每個腫瘤建立了細胞圖譜，并在MIBC或TCGA 2017分類共識背景下進行了分析（圖3a）。有趣的是，由于其獨特的性質(zhì)，CDH12特征分布于Ba/Sq、腔內(nèi)浸潤和神經(jīng)內(nèi)分泌樣亞型，而明顯不存在腔內(nèi)乳頭狀和腔內(nèi)不確定亞型（圖3a）。這與之前的觀察一致，即CDH12群體可能在某種程度上存在于多個先前建立的亞型中（圖1e）。CDH12和巨噬細胞信號是不良DSS的唯一預(yù)測因子（圖3b）。

圖3?高CDH12評分預(yù)測化學耐藥性和成纖維細胞活化

 

4、CDH12評分預(yù)測對新輔助化療的不良反應(yīng)

? ? ? ?作者觀察到低CDH12評分的樣本在化療后傾向于成為高CDH12評分的樣本，而高CDH12評分的樣本在化療后傾向于保持高CDH12評分（圖3c）。腫瘤開始時CD8T評分較低，化療后CD8T評分增加，提示免疫激活。

5、CDH12細胞具有耐化療性并能激活基質(zhì)

? ? ? ? 有趣的是，在化療反應(yīng)中，CDH12評分較低的腫瘤細胞凋亡和免疫激活相關(guān)基因表達增加，而CDH12評分較低的腫瘤細胞表達增加CDH12評分通過纖維母細胞和內(nèi)皮細胞活化對化療有反應(yīng)（圖3d）。作者觀察到CDH12群體與成纖維細胞之間有許多顯著富集的相互作用，其中最顯著的是TGFBR1，CD44和一些整合素，因為它們參與了癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAF）的激活（圖3e）。

6、CDH12評分預(yù)測化療后免疫治療反應(yīng)

? ? ? ? ? 通過免疫激活，作者發(fā)現(xiàn)低CDH12評分的腫瘤化療后PDCD1LG2（PDL2）表達增加，而在所有樣本中，PDL2表達高于PDL1（CD274）表達（圖4a）。之前的觀察與單細胞核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，顯示CDH12細胞在上皮細胞中表達了最高水平的PDL2（圖4b）?；熀蟮臉颖局校珻DH12水平預(yù)示著更好的OS（圖4c）。此外，只有在化療后，CD8T評分和PDL1和PDL2的表達顯示了顯著的預(yù)后價值（圖4c）。CDH12評分也與化療后的病理反應(yīng)相關(guān)，事實上，它是與化療后反應(yīng)顯著相關(guān)的唯一因素，甚至考慮到已建立的一致MIBC亞型（圖4d和e）。

圖4化療后CDH12評分預(yù)測免疫檢查點治療的良好反應(yīng)

7、CDH12細胞通過CD49a和CD8 T細胞相互作用

? ? ? ? 雖然作者再次發(fā)現(xiàn)CDH12上皮細胞和T細胞之間有許多顯著的相互作用，但作者發(fā)現(xiàn)最強的相互作用是在CD8 T細胞上編碼CD49a的ITGA1（圖4f）。在有針對性的檢查點交互分析中，作者發(fā)現(xiàn)CDH12群體與CD8T細胞具有最強的PDL2-PD1和CTLA-4互作，而KRT13和UPK群體通過TIGIT和TIM-3與CD8T細胞互作（圖4g）。

8、CDH12細胞與CD8 T細胞共定位

為了驗證CDH12上皮細胞引起T細胞假說，作者使用Visium空間轉(zhuǎn)錄組和單細胞核轉(zhuǎn)錄組研究腫瘤中基因表達定位。CDH12富集的區(qū)域也富集了CD8T細胞marker和ITGA1（圖5a）。為了驗證CDH12上皮細胞在單細胞水平上與T細胞共定位，作者設(shè)計并使用CODEX平臺對同一腫瘤隊列的腫瘤組織微陣列進行了35位免疫組化檢測（圖5b）。

圖5 CDH12腫瘤細胞優(yōu)先與表達CD49a、PD-1和LAG3的T細胞共定位

 

9、CDH12細胞用耗竭的CD8 T細胞定義細胞生態(tài)位

? ? ? ? ?與Visium空間轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果一致，作者再次使用k近鄰法觀察到CD8T與CDH12上皮細胞比KRT13上皮細胞更接近（圖5c）。相比之下，作者鑒定了2個KRT13上皮細胞富集CD8T細胞未富集的CNs（圖5d）。此外，根據(jù)shannon指數(shù)評發(fā)現(xiàn)CDH12富集的CNs在其組成的細胞類型上比KRT13富集的CNs更具多樣化（圖5e）。

? ? ? ? CDT8細胞存在的CDH12富集的CNs相比于非CDH12富集的CNs，CD49a、PD-1和LAG3高表達（圖5f和g）。相反，左側(cè)表達PD-L2水平較低；三個相關(guān)的CNs中，CN14含有PD-L1和PD-L2表達最高的CDH12細胞這與LAG3表達最高的CD8T細胞一致，促進CD8T細胞的耐受性狀和PD-1的衰竭（圖5f和h）。

研究結(jié)論

? ? ? ? 總之，作者第一次進行了MIBC單細胞核轉(zhuǎn)錄組闡明當前分子亞型的組成，并獲得更高分辨率的具有治療相關(guān)性的分子標記。作者獲得了與特定細胞群、尿上皮分化和瘤內(nèi)空間鄰近相關(guān)的標記基因，這些標記基因提供了比先前基于bulk亞型更優(yōu)的治療相關(guān)性（圖6a）。通過這些發(fā)現(xiàn)作者推測基因表達譜可以幫助患者分類是否受益于NAC（圖6b）。NAC后腫瘤低C3評分可能受益于靶向替代免疫檢查點途徑如TIM3或TIGIT，而高表達的腫瘤可能受益于單藥或聯(lián)合ICT（圖6b）。還為一些基于NAC前C3的評分高的腫瘤患者以及NAC后殘留疾病患者臨床試驗提供了令人信服的理由（圖6b）。