?百邁客單細胞轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品介紹
百邁客單細胞轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)品基于10x Genomics Chromium系統(tǒng)利用8通道的微流體 “雙十字”交叉系統(tǒng)和油滴包裹技術(shù)，在單細胞水平進行高通量基因表達譜檢測，對復雜細胞群深入分析，表征單個細胞的表達譜，避免單個細胞的異質(zhì)性生物學信息被大量細胞的均質(zhì)化覆蓋。通過單細胞轉(zhuǎn)錄組，可鑒定細胞群、細胞亞群、篩選細胞群特有marker基因，并完成對細胞分化軌跡的追蹤，從而解析細胞異質(zhì)性和發(fā)育軌跡。
導讀
背景：骨髓內(nèi)B細胞的分化具有嚴格的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)，這個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的遺傳物質(zhì)的變異是急性淋巴細胞白血病（ALL）出現(xiàn)的基礎(chǔ)，例如ETV6-RUNX1融合基因的出現(xiàn)會導致細胞分化停滯。本研究旨在分析沿B細胞譜系分化軌跡的轉(zhuǎn)錄因子活性，作為表征白血病骨髓中異常細胞狀態(tài)的參考，并確定維持癌癥特異性細胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子，以進行更√確的治療。
方法：使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析正常的B細胞譜系分化和體內(nèi)細胞狀態(tài)。
結(jié)果：從骨髓scRNA-seq中發(fā)現(xiàn)的淋巴樣細胞轉(zhuǎn)錄因子活性與前期ATAC和ChIP-seq數(shù)據(jù)高度一致。使用這種調(diào)節(jié)B細胞譜系分化的調(diào)節(jié)因子作為綜合參考，本研究對ETV6-RUNX1融合基因陽性的ALL病例的分析揭示了白血病細胞中多種ETS轉(zhuǎn)錄因子的活性升高，包括白血病全基因組關(guān)聯(lián)研究中ELK3?；虮磉_變化與白血病免疫微環(huán)境中的自然殺傷細胞失活和耗竭有關(guān)。此外，結(jié)果表明診斷時細胞周期在G1期的細胞越豐富，誘導化療期間缺乏分化相關(guān)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)變化，這兩個特點代表了化療耐藥的特征。為了靶向白血病調(diào)節(jié)程序，克服治療耐藥性，本研究表明抑制ETS轉(zhuǎn)錄因子會降低細胞活力。
結(jié)論：本研究提供了表征正常和白血病骨髓中B細胞譜系分化中轉(zhuǎn)錄因子活性的詳細圖譜，并為針對白血病免疫微環(huán)境和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的新治療策略提供了基礎(chǔ)。
實驗方法
材料：急性淋巴細胞白血病（ALL）初診和化療15天的骨髓樣本（BM）
方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序、ATAC-seq、CHIP-seq、轉(zhuǎn)錄組測序
研究結(jié)果
1、在單細胞轉(zhuǎn)錄組中捕獲骨髓B細胞譜系分化軌跡
從具有11個cluster的HSC中分離出B細胞用于進一步分析（圖 1a），DNA轉(zhuǎn)移酶（DNTT，也稱為 TdT）和MME（也稱為CD10）基因區(qū)分早期淋巴祖細胞（LP，cluster 3），它們進展為表達CD19和G1期pro-B細胞狀態(tài)（圖 1b）。此外，3個pre-B細胞cluster（缺乏DNTT表達）在圖譜上分離。pre-B II和未成熟B細胞簇由MS4A1（CD20）定義。擬時序分析如圖1c所示?；诖朔治龅募毎麪顟B(tài)之間的進展與指定的分化階段一致。這些細胞狀態(tài)注釋也與使用流式分選B細胞群評分高度一致（圖 1d）。然而，這些由大量轉(zhuǎn)錄組定義的基因組僅在循環(huán)細胞狀態(tài)中得分很高。因此，本研究還從單細胞分析中區(qū)分了每個cluster的marker基因，以研究BM中B細胞譜系細胞狀態(tài)的分配。為了驗證，本研究選了兩個獨立的BM數(shù)據(jù)集：分別是健康的成人捐贈者和三個兒童BM樣本。從這兩種分析中，可以重現(xiàn)觀察到的B細胞譜的連續(xù)性。為了描繪表征早期B細胞譜系分化中細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的基因表達變化，本研究沿著偽時間軌跡（HSC→LP→pro-B→pre-B→未成熟 B 細胞狀態(tài)）依次比較了細胞cluster。使用scDD區(qū)分了2201個基因的mRNA變化、平均表達的差異和模式，并且HCA和兒童BM之間具有高度的一致性?；赗NA速度分析該基因組的RNA動力學，進一步解析了B細胞譜系的細胞狀態(tài)（圖 1e）。在該分析中，剪接和未剪接計數(shù)均用于評估基因表達變化的速度，從而通過基因調(diào)控動態(tài)擴展細胞狀態(tài)表征。這由首先上調(diào)的 DNTT（圖 1f）說明這些細胞周期狀態(tài)和細胞周期中mRNA水平的變化 （圖1g）。
圖1 骨髓scRNA-seq中分離的B淋巴樣細胞分化狀態(tài)
2、TF活性變化揭示了B細胞分化的調(diào)控動態(tài)
沿B細胞譜系軌跡的細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換受TF嚴格控制。為了表征TF、共調(diào)節(jié)因子（CR）、染色質(zhì)修飾（CM）和剪接/轉(zhuǎn)錄復合物（ST）的活動，使用在訓練集和測試集中可重復識別的TF作為線性模型擬合分析細胞狀態(tài)的重要預測因子。B細胞譜系分化階段的TF活性評分如圖2a所示。主要調(diào)節(jié)B細胞譜系循環(huán)的TF的表達水平見圖2b。EBF1、FOXO1、LEF1和TCF4與ETS因子ERG和FLI1一起在pro-B細胞中顯示出*高的活性（紅色），而TCF3和PAX5在pro-B細胞和pre-B細胞中的活性都相似。SPIB和IRF4活性在pre-B細胞中升高；一些已知的具有抑制功能的TF，如BCL11A和已知的協(xié)同抑制復合成分HDAC2 和TBL1XR1，它們與糖皮質(zhì)激素受體相互作用以促進終末分化。
作為獨立驗證，首先從pro-B細胞中檢索了大量ATAC-seq數(shù)據(jù)，顯著富集的TF motif證實了與pro-B G1期細胞相關(guān)的9個TF（EBF1、FOXO1、TCF3、RFX5、IRF1、TCF4、LEF1、ERG、FLI1）（圖 2c）。pro-B活性TF在兒童BM數(shù)據(jù)集中也具有高度相似的活性譜（圖 2d）。接下來，分析了包括TF與目標基因表達相關(guān)性，以及每個目標基因位點的TF motif。根據(jù)發(fā)現(xiàn)集中找到的TF，在訓練/測試集中預測它們的靶基因。為了測試預測的靶基因是否受TF調(diào)控，本研究檢索了PAX5、EBF1和BCL11A的ChIP-seq數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在人類細胞系模型 Nalm-6中可用，使用GREA T獲得與基因關(guān)聯(lián)的peak。對于PAX5和EBF1，超過75%的預測目標具有ChIP-seq peak關(guān)聯(lián)（圖 2e）。ATAC-seq motif富集與基于ChIP-seq的TF靶基因位點驗證，結(jié)果高度一致，證明TF活性評分反映了調(diào)節(jié)作用。說明本研究對健康人BM單細胞轉(zhuǎn)錄組的分析為基因表達和TF活性變化提供了全面的參考，這些變化表征了單細胞分辨率下早期B細胞譜系分化的特征。
圖2 調(diào)節(jié)B細胞譜系分化的轉(zhuǎn)錄因子活性
3、E/R白血病細胞類似于pro-B細胞狀態(tài)，并在細胞周期活動中表現(xiàn)出異質(zhì)性
為了表征ALL（E/R）中常見的TF融合的白血病細胞，本研究對6個兒童E/R+ pre-B-ALL病例進行了scRNA-seq，收集6個診斷期和2個誘導化療第15天的BM樣本（圖 3a）?；贒NTT表達及其與正常BM細胞類型的明確分離，確定了每個供體中的白血病細胞簇（圖 3b）?；贐細胞譜系簇特異性基因集，發(fā)現(xiàn)診斷時白血病母細胞類似于pro-B分化狀態(tài)（圖 3c）。該分析同樣將pro-B細胞鑒定為*接近的正常分化狀態(tài)，這與之前的研究一致。細胞周期狀態(tài)在不同情況下不同，ALL3中的循環(huán)細胞比例*低，ALL9中的*高比例（圖 3d）。對于具有中期誘導治療的2個病例（ALL10 和 ALL12），在第15天收集的樣本中細胞分離為不同的細胞狀態(tài)（圖 3a、d），表明治療進一步改變了白血病細胞狀態(tài)。
通過分別比較循環(huán)和G1期細胞與正常pro-B細胞的基因表達分布，進一步表征診斷時E/R白血病細胞與pro-B細胞的不同。該分析是基于HCA健康人BM和兒童BM pro-B細胞進行的。對于大多數(shù)基因，正常B細胞譜系分化時*顯著的變化是ZP指標，該指標捕獲感興趣基因計數(shù)為零的細胞部分，例如前50個上調(diào)和下調(diào)的基因在 pro-B到pre-B中的過渡。因此，本研究使用ZP對來自HCA的E/R+和pro-B細胞的G1期和循環(huán)細胞狀態(tài)比較中發(fā)現(xiàn)的272個上調(diào)和90個下調(diào)基因進行聚類（圖 3e）。與沿B細胞譜系分化軌跡的其他細胞狀態(tài)相比，大約1/3的上調(diào)基因在 E/R+ 細胞（cluter 4）中處于*高水平，而cluter 1、2、5 和 6 中的基因在白血病和正常干/祖細胞中表達（圖 3e）。一小部分（19 個基因，cluter 8）在正常的未成熟 B 細胞中高度表達，并且發(fā)現(xiàn)16個基因僅與小兒BM相比具有顯著性?？紤]到一些基因表達模式類似于pre-B 細胞狀態(tài)，但白血病細胞似乎停滯在pro-B狀態(tài)，因此進一步確定了在pro-B到pre-B過渡中通常受調(diào)節(jié)的基因，發(fā)現(xiàn)其他基因與分化停滯有關(guān)。總的來說，在過渡到pre-B狀態(tài)時正常上調(diào)的 97 個基因保持在與正常 pro-B 細胞相似的低水平，而在分化過程中下調(diào)的145個基因在白血病細胞中仍然表達。
通路富集分析顯示，一些上調(diào)基因與細胞因子、趨化因子和生長因子通路相關(guān)，特別是那些參與NK細胞介導的細胞毒性負調(diào)節(jié)的基因。之前在ALL中的一項研究表明，免疫逃避中 TGF-β增加。因此，與E/R+ G1期細胞向pro-B G1期細胞的表達分布相比，TGFB1和有助于降低NK細胞募集和激活的3個基因LY6E、TERF2和HLA-E上調(diào)表達（圖 3f）。
圖3 E/R+細胞與正常pro-B細胞的比較
4、E/R+ BM免疫微環(huán)境中NK細胞的豐度和活性較低
對BM免疫細胞進一步分析，發(fā)現(xiàn)與HCA BM供體相比，E/R+ BM中的GNLY或NKG7陽性NK細胞數(shù)量顯著減少（圖 4a）。此外，根據(jù)流式細胞分離數(shù)據(jù)，淋巴細胞中的NK細胞計數(shù)在E/R+與非E/R pre-B-ALL中*低（p=0.025）。
為了進一步表征免疫細胞群，將HCA和E/R+ ALL供體的T細胞和NK細胞匯集在一起進行聯(lián)合分析。基于聚類和marker基因分析，可以區(qū)分幾種不同的NK細胞類型（圖 4b、c）。篩選表達GNLY或NKG7的cluster（cluster 0、2、3、7、10、11、16），發(fā)現(xiàn)與來自HCA供體的NK細胞相比，來自ALL BM的NK細胞被隨機分配給這些cluster（圖 4d）。具體來說，所有NK細胞主要代表cluster 10和16，它們與表達未成熟CD56bright 和過渡NK細胞的顆粒酶 K（GZMK）相匹配（圖 4e 中的基因組評分代表來自scRNA-seq研究的NK亞型）。相比之下，大多數(shù)正常 BM NK細胞代表表達顆粒酶 B（GZMB）和穿孔素（PRF1）的成熟或終末NK細胞（cluster 0）。因此，E/R+白血病細胞可能會主動逃避NK細胞的細胞毒性，然而，NK類型的頻率因供體而異（圖 4f）。高表達IFNG的cluster 7幾乎完全對應于HCA供體 3，而與其他ALL病例相比，細胞周期高度活躍的ALL8和ALL9更類似于正常BM中的成熟或活性NK細胞譜?？傊?，白血病細胞狀態(tài)與正常pro-B分化狀態(tài)的不同之處在于干/祖細胞特異性基因和幾種免疫調(diào)節(jié)基因的高表達。免疫調(diào)節(jié)基因的變化反映為E/R+ BM內(nèi)更多不成熟的NK細胞類型。
圖4 E/R+骨髓中的NK細胞數(shù)量和活性較低
5、白血病調(diào)節(jié)程序揭示了 TF 活動中的細胞狀態(tài)和白血病相關(guān)風險基因
為了進一步破譯有助于將E/R+白血病細胞與正常淋巴細胞狀態(tài)區(qū)分開的異常TF活性，本研究重復了TF活性分析（圖 5a）。2/3通過線性模型擬合的TF（R2 > 0.5）在pro-B細胞中有活性，在E/R+細胞中活性升高，包括ETS因子（ELK3、ERG、FLI1）、FOXO1、MAX、MAZ 、SP4、TCF4和THAP11。分析還揭示了RFX5和NFYC在 E/R+原始細胞中的高活性，通常僅在未成熟的B細胞狀態(tài)下達到峰值。此外，E/R+細胞中活性下降的TF包括 RUNX1、SPIB、TCF3 和 IRF4（圖 5a）。
基于bulk RNA分析可以驗證它們在B-ALL中的表達，在E/R+亞型（紅色箭頭）中檢測到的比例*高，如在t-SNE圖上比較血液系統(tǒng)惡性腫瘤所示（圖 5b），其中惡性淋巴瘤在圖上突出顯示。兩種常見的B-ALL亞型（E/R+和高超二倍體病例）顯示出類似的高ELK3，而升高的SP4則更具 E/R 特異性，進一步分析了E/R+細胞中的這些TF基因座（圖 5c）。本研究使用GRO-seq對E/R+ BM中的新生轉(zhuǎn)錄進行了分析，揭示了Pol2參與編碼和非編碼區(qū)的主動起始和延伸。GRO-seq 證實了這些基因位點在 E/R+細胞中的轉(zhuǎn)錄活性（圖 5c）。此外，還揭示了ELK3上游未注釋（Refseq、UCSC 或 Gencode）的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）（圖 5c）。兩個lncRNA庫在該基因組區(qū)域內(nèi)具有匹配的轉(zhuǎn)錄本，但注釋之間的一致性很差。因此，在E/R+ BM（n = 8，scRNA-seq 和 GRO-seq 分析中的匹配樣本）中使用配對的bulk RNA-seq 進一步檢測了該基因座內(nèi)的剪接模式。帶注釋的ELK3轉(zhuǎn)錄本具有來自剪接點跨越reads的支持，而上游轉(zhuǎn)錄本與lncRNA結(jié)構(gòu)*匹配（圖 5c）。
圖5 E/R+白血病細胞中的TF活性
6、化療期間持續(xù)存在的白血病TF為克服耐藥性提供了新的靶點
基于在ALL10和ALL12中誘導治療中期獲得的scRNA-seq譜分析了標準白血病誘導治療（潑尼松龍、長春新堿、多柔比星）對 TF表達的影響（圖 5d）?；诓町惙植挤治觯c兩個樣本中的診斷時狀態(tài)相比，來自第15天骨髓的殘余白血病母細胞具有較低的RUNX1、TCF3、SOX4和ERG表達，而SMAD1和ELK3水平略有增加。在第29天誘導結(jié)束時，ALL10的原始細胞減少（0.08%）。在第15天，pre/未成熟B TFs POU2F2、KLF2/6、AFF3和SPIB在ALL10的剩余白血病細胞（10%原始細胞）中的表達升高。這些變化可能與糖皮質(zhì)激素的分化誘導作用有關(guān)。但總體而言，TF活性或基因表達的變化不大，表明盡管成熟CD20（由MS4A1編碼）增加，但僅可能發(fā)生向pre-B細胞狀態(tài)的部分分化。相比之下，ALL3和ALL12對治療的反應緩慢（第 15 天的原始細胞率為74%和59%；誘導結(jié)束時分別為0.16%和0.2%）。ALL3與其他E/R+病例相比，診斷時細胞周期狀態(tài)分布強烈偏向G0/G1狀態(tài)（圖 3d），這可能是對靶向分裂細胞的藥物（阿霉素/長春新堿）耐藥的基礎(chǔ)。ALL12第15天TF譜表明白血病基因調(diào)控程序的持續(xù)性，表現(xiàn)為缺乏pre-/未成熟B TF上調(diào)（圖 5d）。
總結(jié)
該研究首次全面表征了E/R+ ALL病例中的細胞狀態(tài)和TF 活性，并將其與單細胞分辨率下的正常人類 B細胞譜系分化進行了比較，進一步證明了使用單細胞基因組學監(jiān)測早期治療反應的可行性及其發(fā)現(xiàn)新治療靶點的潛力。通過對單細胞和大量基因組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，表征了導致白血病細胞異常細胞表型的TF譜。這些結(jié)果可以為開發(fā)針對白血病免疫細胞串擾和治療抗性白血病細胞狀態(tài)的新療法提供合理的依據(jù)。
原文下載鏈接：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33218352
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