繼單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)之后，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)登上2020年Nature Methods 年度技術(shù)的封面，可以說(shuō)空間轉(zhuǎn)錄組引領(lǐng)科研領(lǐng)域的主導(dǎo)風(fēng)向標(biāo)。
空間轉(zhuǎn)錄組則更是帶來(lái)了組織細(xì)胞空間信息，提供單細(xì)胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄組視角，令科學(xué)家為之振奮。目前10 visium平臺(tái)率先開(kāi)發(fā)動(dòng)物冷凍樣本和人FFPE樣本空間轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)，已經(jīng)在人和鼠上有大量的研究報(bào)道。然而植物在空間轉(zhuǎn)錄組上研究報(bào)道并不多，瑞典斯德哥爾摩皇家理工學(xué)院Stefania團(tuán)隊(duì)在Nature Plant（2017）[1] 、Nature Protocols(2018)[2]連續(xù)報(bào)道了擬南芥花序、楊樹(shù)葉芽、冷杉雌球果在空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)上研究，但是植物空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)仍然存在太多難題難以突破。
百邁客基于大量的植物組織研究的經(jīng)驗(yàn)，借助10x visum平臺(tái)率先突破了植物空間轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用難題?？梢哉綖閺V大老師提供植物空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)，讓我們一起來(lái)看看植物空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)難點(diǎn)和突破。
植物組織冷凍包埋
不同于動(dòng)物組織的冷凍包埋，植物組織結(jié)構(gòu)上跟動(dòng)物組織存在很大差異性，特別是植物組織存在較硬的細(xì)胞壁以及含水量很高的大液泡等結(jié)構(gòu)，常規(guī)冷凍后的植物組織器官硬度大，形成的冰晶多，從而不易獲得高質(zhì)量的切片。有一些研究報(bào)道對(duì)關(guān)于植物中不同組織器官冰凍切片技術(shù)的應(yīng)用及方法進(jìn)行了探討，但這些方法大多數(shù)是將植物材料經(jīng)過(guò)FAA、多聚甲醛或乙醇等固定液固定、以及一定濃度的甘油處理或液氮速凍等處理后才能得到較好的切片效果，不僅切片條件各異，而且操作過(guò)程也較為復(fù)雜，對(duì)于初學(xué)者較難掌握。另外對(duì)于切面組織間木質(zhì)化程度差異大、直徑較大且髓部含有較大面積海綿狀細(xì)胞的植物組織器官（如甘藍(lán)型油菜發(fā)育成熟的主莖）也很難獲得完整的切片。因此需要選擇合適冷凍保護(hù)劑處理植物組織，這里推薦利用蔗糖溶液作為冷凍保護(hù)液，將植物組織放在合適濃度蔗糖溶液中固定，用對(duì)應(yīng)濃度的蔗糖磷酸緩沖液浸洗，最后抽真空[3]。
圖1. 合蕊柱適合條件(16%蔗糖磷酸緩沖液，切片厚度 10 μm)冷凍切片效果
一般冷凍包埋有三種常見(jiàn)方法：1）直接包埋法，預(yù)處理的材料直接用包埋劑（水凝膠/OCT包埋劑）在-20℃冷凍切片機(jī)上低溫冷凍處理；2）液氮速凍法：材料經(jīng)常規(guī)方法固定和清洗后 , 先用包埋劑包裹在適當(dāng)大小的盒內(nèi) , 再用液氮迅速速凍20s,再將樣品放進(jìn) － 20 ℃ 速凍 20 ～30 min；3）異戊烷OCT冷凍包埋法：將異戊烷容器置于液氮中冷卻3-5分鐘，直至異戊烷從流動(dòng)液體狀轉(zhuǎn)為粘稠液體，將包埋盒中材料放在異戊烷，當(dāng)OCT由透明轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆煌该鞯陌咨珪r(shí)，取出包埋盒并放入-80℃冰箱保存。
經(jīng)過(guò)蔗糖保護(hù)的組織可以通過(guò)液氮或者異戊烷冷凍包埋，經(jīng)過(guò)處理的包埋塊可以進(jìn)行切片或者超低溫保存，后續(xù)切片可完整保存植物組織原始的狀態(tài)。植物空間轉(zhuǎn)錄組對(duì)于樣本的前期處理非常重要，冷凍包埋的效果是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素，包埋過(guò)程中組織中或者周圍不能產(chǎn)生氣泡，以及處理的樣本要快速進(jìn)行冷凍包埋。
圖2. 植物組織異戊烷OCT冷凍包埋塊
植物組織冷凍切片
動(dòng)物組織樣本細(xì)胞類型，結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡(jiǎn)單，切片厚度比較統(tǒng)一，基本上保持在10μm厚度左右。但是植物樣本組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且木質(zhì)化程度不一，組織相對(duì)RNA含量較低，因此植物切片厚度一般根據(jù)樣本類型不同，選擇不同的切片厚度，一般植物冷凍切片厚度范圍為10-50um,根據(jù)物質(zhì)組織類型切片厚度會(huì)有所不同，視具體情況而定。
圖3. 植物組織冷凍切片
植物組織冷凍切片染色
動(dòng)物組織常用HE（蘇木精-伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining )）染色，可以精準(zhǔn)識(shí)別組織形態(tài)和病理學(xué)鑒定。然而植物的組織存在的纖維素和一些木質(zhì)素不適合HE染色方法，采取的是甲苯胺藍(lán)染色法，其基本原理是植物組織木質(zhì)化細(xì)胞壁呈藍(lán)綠色，其他組織成分呈紫藍(lán)色，可以精準(zhǔn)輔助判斷植物組織形態(tài)學(xué)和確定捕獲區(qū)域。
圖4. 百邁客植物組織切片染色數(shù)據(jù)
植物組織優(yōu)化
較大的難點(diǎn)是組織優(yōu)化，由于植物組織結(jié)構(gòu)木質(zhì)化程度不一樣，RNA含量水平偏低，植物組織的RNA透化難度大大加大，要想獲得足夠的RNA，根據(jù)Stefania[2]的方法我們自主優(yōu)化了植物組織透化試劑，使用組合酶的方法，其試劑效果可保證RNA被完全透化下來(lái)，解析植物組織空間位置所有RNA表達(dá)。
圖5. 植物組織透化酶的選擇參考 Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.
植物空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要解決空間異質(zhì)性的問(wèn)題，那么該技術(shù)在植物領(lǐng)域有哪些應(yīng)用呢？我們知道植物成長(zhǎng)過(guò)程中組織不同位置基因表達(dá)模式的差異會(huì)呈現(xiàn)不同的表型，空間轉(zhuǎn)錄組在植物上提供一種新的視角探討植物組織器官空間基因表達(dá)模式，主要可以圍繞生長(zhǎng)發(fā)育（育種）、抗逆應(yīng)激（生物脅迫和非生物脅迫）、免疫反應(yīng)和致病機(jī)理、生物進(jìn)化等幾個(gè)方面研究植物上一些生物學(xué)現(xiàn)象和表型，從而提供更高分辨率時(shí)空多維度解析科學(xué)問(wèn)題。接下來(lái)我們舉幾個(gè)實(shí)際案例分享植物空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用：
（1）擬南芥花序 植物生長(zhǎng)發(fā)育-Natrue Plants,2017[1]
Stefania和 Joakim Lundeberg團(tuán)隊(duì)在2017年就開(kāi)發(fā)了植物上空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，通過(guò)模型被子植物（擬南芥）和裸子植物（楊樹(shù)、挪威云杉）的微觀切片生成空間轉(zhuǎn)錄組譜來(lái)證明該技術(shù)的可行性。該技術(shù)捕獲區(qū)域?yàn)?.2*6.6mm2，含有1007spot,每個(gè)spot的直徑距離是100μm,可以檢測(cè)到植物組織在空間維度的所有RNA分子的表達(dá)。
文中首先鑒定楊樹(shù)休眠期和發(fā)育期葉芽不同組織區(qū)域基因表達(dá)特征，證實(shí)了技術(shù)檢測(cè)的z確性、靈敏度以及重復(fù)性。休眠期（冬季）和發(fā)育期（夏季）葉芽一共檢測(cè)到17043個(gè)基因，樣本每個(gè)spot檢測(cè)到基因中位數(shù)為2929，轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)中位數(shù)為8061，跟休眠期相比，在發(fā)育期葉芽中有408高表達(dá)的基因，在發(fā)育芽還是休眠芽組織切片中，高表達(dá)的基因在同一組切片之間和不同組的復(fù)制芽切片之間的表達(dá)模式清晰一致，無(wú)論生物學(xué)重復(fù)還是技術(shù)重復(fù)都證實(shí)該方法的重顯性和√確性。
圖6. 楊樹(shù)休眠芽和發(fā)育芽空間基因表達(dá)特征重現(xiàn)性
擬南芥花苞中空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)莖、分生組織、以及3個(gè)不同花區(qū)域空間基因表達(dá)，一共檢測(cè)到20215個(gè)基因,鑒定開(kāi)花有關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵基因At5g57720（已知的在S3和S9表達(dá)的基因）和 ATA27 (At1g75940，已知的在S11和S12表達(dá)的基因)的√確的空間定位可視化，組織區(qū)域特異性基因和通路的顯著差異，發(fā)現(xiàn)雄蕊絲發(fā)育通路在S11(雄蕊絲伸長(zhǎng)的位置)和莖中富集，在莖中維管通道大量存在，并且細(xì)胞伸長(zhǎng)和維管發(fā)育過(guò)程非?；钴S。其中花粉外壁形成途徑在S10和S11發(fā)生改變，在這個(gè)階段，外壁是花粉壁的主要組成部分之一，在絨氈層產(chǎn)生并沉積在花粉前細(xì)胞上?？臻g基因表達(dá)特征揭示了組織區(qū)域異質(zhì)性，并為植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和相應(yīng)功能的探索提供了高分辨率的空間植物基因表達(dá)模式，從新的維度探索植物發(fā)育過(guò)程。
圖7. 擬南芥花序空間基因表達(dá)特征
（2）擬南芥花序、楊樹(shù)葉芽、冷杉雌球果 植物生長(zhǎng)發(fā)育-Nat Protoc, 2018[2]
Stefania和 Joakim Lundeberg團(tuán)隊(duì)2018年繼續(xù)在更多的裸子植物、被子植物轉(zhuǎn)錄組本空間模式探索，提供了不同的植物類型細(xì)胞壁采用不同的酶混合物處理方法，以及植物組織冷凍和透化優(yōu)化、組織去除的方法，而擬南芥花序、楊樹(shù)葉芽、冷杉雌球果，特別高度異質(zhì)性的組織部位，精準(zhǔn)提高了植物空間基因檢測(cè)的的特異性（~93%）、z確性（~71%）以及靈敏度（~60%）。
圖8. 擬南芥花序、楊樹(shù)葉芽、冷杉雌球果空間基因表達(dá)
（3）擬南芥葉片-植物對(duì)細(xì)菌攻擊的免疫反應(yīng)途徑 Plant Methods. 2019[4]
Michael Giolai等人利用 GaST-seq技術(shù)，檢測(cè)擬南芥葉片8個(gè)區(qū)域（1mm2）空間基因表達(dá)特征，探討解刨誘導(dǎo)的基因應(yīng)激表達(dá)，以及葉片組織空間特異性基因表達(dá)，中脈與葉脈差異表達(dá)基因393個(gè)，葉緣與葉脈差異表達(dá)基因有686個(gè)；同時(shí)細(xì)菌分子鞭毛蛋白- flg22感染葉片不同組織區(qū)域，發(fā)現(xiàn)與水處理相比較，不同區(qū)域感染后產(chǎn)生差異表達(dá)基因數(shù)目不一樣， flg22誘導(dǎo)后根據(jù)其在葉面積上的空間表達(dá)模式√確地聚為36個(gè)簇，而且這些基因主要富集在應(yīng)激和防御反應(yīng)相關(guān)的生物過(guò)程，探索植物器官內(nèi)部空間差異和細(xì)菌PAMPs的生物刺激所引起的變化的反應(yīng)機(jī)制。
圖9. 擬南芥葉片對(duì)病原體的免疫反應(yīng)空間基因表達(dá)特征
（4）挪威云杉雌芽 植物生殖育種 UPPSALA UNIVERSITET, 2020[5]
挪威云杉是瑞典經(jīng)濟(jì)的重要出口樹(shù)種，它可能需要20-25年的樹(shù)木成熟時(shí)期。為了培育優(yōu)良品種， Stefania Giacomello and Jens Sundstr?m結(jié)合10x Visium技術(shù)進(jìn)一步研究挪威云杉野生型和早期圓錐形突變體Picea abies var. acrocona的雌性生殖發(fā)育中的空間基因表達(dá)模式，該技術(shù)捕獲區(qū)域?yàn)?.5mm*6.5mm，含有5000個(gè)spot,每個(gè)spot直徑為55μm,以更高的分辨率鑒定云杉雌芽的空間發(fā)育特征。選取三個(gè)類型不同時(shí)期挪威云杉（Wildtype, Acrocona or Vegetative；August, September, October）作為研究材料，一共檢測(cè)了16個(gè)樣本，每個(gè)樣本檢測(cè)到26000個(gè)基因左右，每個(gè)spot基因檢出率為525-1855個(gè)。
圖10. 挪威云杉雌芽空間轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)
UMAP對(duì)樣本進(jìn)行批次效應(yīng)分析，可視化展示16個(gè)樣本空間基因表達(dá)聚類可視化圖。
圖11. 挪威云杉雌芽不同樣本聚類可視化
野生型、突變株從8月、9月份、10月份空間差異表達(dá)marker基因鑒定，發(fā)現(xiàn)雌芽（F）和營(yíng)養(yǎng)芽（V）類型之間的生長(zhǎng)差異，cluster 1在F和V的9月中表達(dá)分布存在差異，主要富集在外部組織區(qū)域，可能是雌性的不育苞片和營(yíng)養(yǎng)芽中的針部組織。不同組織區(qū)域、不同生長(zhǎng)時(shí)期云杉葉芽存在組織空間區(qū)域特異性，突變體acrocona空間基因表達(dá)的理解可能會(huì)加速在野生型P.abies的遺傳實(shí)驗(yàn)，并改善挪威云杉的生長(zhǎng)周期，加快優(yōu)良品種的培育。
圖12. 挪威云杉不同區(qū)域marker基因的鑒定分布圖
以上目前植物空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)難點(diǎn)和突破點(diǎn)，百邁客已經(jīng)一一攻克這些難點(diǎn)，完成植物在空間實(shí)現(xiàn)了高通量測(cè)序。
如果對(duì)植物空間轉(zhuǎn)錄組感興趣的老師，想要開(kāi)展相關(guān)研究，可以電話咨詢提供植物空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
欲知更多百邁客植物空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，盡在下期分享，敬請(qǐng)期待。
參考文獻(xiàn)：
[1] Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017 May 8;3:17061.
[2] Giacomello S, Lundeberg J. Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomics profiling using barcoded microarrays. Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.
[3]陸振芳, 蔣素華, 江敏,等. 蝴蝶蘭花器官冰凍切片技術(shù)探討[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 053(002):200-206.
[4] Giolai, M., Verweij, W., Lister, A. et al. Spatially resolved transcriptomics reveals plant host responses to pathogens. Plant Methods 15, 114 (2019).
[5] A spatial analysis of Norwegian spruce cone developmental stages. UPPSALA UNIVERSITET, 2020.
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