【案例解讀】【PNAS】【微生物多樣性】全球范圍海洋沉積物的微生物多樣性研究

中文名: 全球范圍海洋沉積物的微生物多樣性研究

英文名: Global diversity of microbial communities in marine sediment

雜志：PNAS，2020

影響因子：9.58

研究背景

海洋沉積物富含生物質(zhì)，并且它是未知的微生物多樣性的來(lái)源，微生物細(xì)胞密度高達(dá)每立方厘米109個(gè)細(xì)胞（比水體高出五個(gè)數(shù)量級(jí)）。海洋沉積物包括粘土，腐爛的有機(jī)物，鈣質(zhì)殘余物和其他固體沉積物。
海洋沉積物中的微生物群落控制生態(tài)過(guò)程，影響?zhàn)B分供應(yīng)和土壤化學(xué)特性。海洋環(huán)境是地球上最具生產(chǎn)力的生態(tài)系統(tǒng)之一，但是人為影響對(duì)于海岸生態(tài)多樣性產(chǎn)生明顯影響，導(dǎo)致微生物群落功能轉(zhuǎn)變和人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)因素。海洋沉積物中的微生物對(duì)全球生物量的貢獻(xiàn)巨大，是地球系統(tǒng)的重要組成部分。海底沉積物既包括好氧微生物生態(tài)系統(tǒng)，也包括厭氧微生物生態(tài)系統(tǒng)，它們?cè)诓煌牡刭|(zhì)時(shí)期依靠著極低的生物可用能量生存。然而，海洋沉積微生物群落的分類(lèi)多樣性及其在全球范圍內(nèi)的空間分布一直沒(méi)有得到深入的調(diào)查和研究。

材料方法

1、實(shí)驗(yàn)樣本：
作者通過(guò)調(diào)查了來(lái)自全球分布的40個(gè)不同地點(diǎn)，共299個(gè)沉積物巖芯樣品。這些樣品位于海底以下0.1-678米的深度位置，樣品采集后立即冷凍于-80℃環(huán)境中保存。

圖1 采樣地點(diǎn)的位置。紅色圓圈分別表示海洋邊緣站點(diǎn)，紅色方塊分別表示開(kāi)放海洋站點(diǎn)。淺藍(lán)色和深藍(lán)色區(qū)域分別顯示整個(gè)沉積物中可能發(fā)生溶解氧和有氧活動(dòng)的最大和最小區(qū)域。在14次科學(xué)考察中，從40個(gè)地點(diǎn)采集了海底以下許多不同深度的299個(gè)沉積物樣本，用于比較不同全球海底沉積物微生物群落組成。

2、實(shí)驗(yàn)和分析方法

使用試劑盒提取DNA，以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出細(xì)菌的16S核糖體區(qū)，使用引物對(duì)(U515F/U806R；518F/926R；517F/958R)進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增和測(cè)序，共獲得超過(guò)4700萬(wàn)條16S rRNA基因序列。將Archaea、Bacteria和Universal datasets分別抽平至10,183、10,092和10,546條序列，并通過(guò)5個(gè)SAR模型用于鑒定多樣性特征。

圖2 實(shí)驗(yàn)分析流程參考

研究結(jié)果

1、古菌和細(xì)菌的群落物種組成
缺氧海底沉積物中古菌群落的分類(lèi)學(xué)組成與含氧海底沉積物中的古菌群落區(qū)系組成顯著不同（圖3 A和C）。圖3A顯示了古菌測(cè)序文庫(kù)的結(jié)果，用于展示235個(gè)沉積物樣本的古菌群落組成，Crenarchaeota的成員分布最為廣泛。Euryarchaeota和Asgardaeota在某些厭氧地區(qū)中非常豐富，例如波羅的海和Shimokita Peninsula半島。一些來(lái)自日本海、秘魯邊緣和ShimokitaPeninsula半島的樣本中，Hadesarchaeaeota高達(dá)古菌群落的70%以上，其相對(duì)豐度隨著沉積物深度的增加而增加。Nanoarchaeaeota的成員在最深層沉積物樣品中豐度最高，約占比95%。而在有氧環(huán)境中，Thaumarchaeota（例如Nitrososphaera）的成員占據(jù)主導(dǎo)地位。在3,892條古菌擴(kuò)增子序列中，在古菌數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到的ASV中有260個(gè)ASV是常見(jiàn)的，這260個(gè)ASV約占古菌序列總數(shù)的70%。

使用通用引物對(duì)獲得的古菌群落組成與使用古菌特異性引物獲得的群落組成略有不同。對(duì)于大多數(shù)沉積物樣品，Asgardaeota在通用引物獲得的數(shù)據(jù)集里占據(jù)主導(dǎo)地位，而Crenarchaeota和Euryarchaeota在古菌專(zhuān)用引物數(shù)據(jù)集中占主導(dǎo)地位。這些差異證實(shí)了引物覆蓋范圍會(huì)影響表觀的物種群落組成。盡管兩個(gè)引物擴(kuò)增的數(shù)據(jù)集之間存在細(xì)微的差異，但兩個(gè)數(shù)據(jù)集都表明缺氧沉積物中的古菌群落與含氧沉積物中的古菌群落顯著不同。例如，古菌專(zhuān)用引物數(shù)據(jù)集和通用引物數(shù)據(jù)集都顯示Thaumarchaeota僅在來(lái)自含氧沉積物的樣品中占主導(dǎo)地位。
對(duì)于大多數(shù)樣品而言，通用引物數(shù)據(jù)集中的古菌相對(duì)豐度低于10%（圖3C），盡管由于PCR效率的差異，該結(jié)果不是定量的。先前的研究使用數(shù)字PCR定量技術(shù)來(lái)確定開(kāi)放海洋沉積物和邊緣海洋沉積物中古菌的百分比分別為5.6和22.6%。本研究中的百分比分別為4.3和12.2%。盡管這些百分比略低于先前的研究，但它們一致表明在海底沉積物中細(xì)菌的豐度高于古菌，且占主導(dǎo)地位。

與古菌群落類(lèi)似，缺氧沉積物中的細(xì)菌群落與含氧沉積物中的細(xì)菌群落存在很大差異（圖3B和C）。從細(xì)菌特異性引物和通用引物獲得的細(xì)菌群落組成大致一致。在含氧的海底沉積物中，包括Alphaproteobacteria和Betaproteobacteriales（γ-proteobacteriaes）在內(nèi)的Proteobacteria成員與Firmicutes成員一起占主導(dǎo)地位。相反，缺氧沉積物中普遍存在Atribacteria、Chloroflexi和Planctomycetes的成員。但是，一些缺氧沉積物，例如從孟加拉灣采集的樣本，典型的含氧沉積物細(xì)菌群落占據(jù)了較高的豐度。盡管厭氧和需氧細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)成員之間存在一致的差異，但厭氧和需氧菌群落共有30,874個(gè)ASV中的5,212個(gè)。這5212個(gè)ASV共同構(gòu)成了作者數(shù)據(jù)集中16SrRNA序列的大約80%。

圖3 海洋沉積微生物群落的物種區(qū)系組成。（A）使用古菌特異性引物獲得的235個(gè)樣品的古菌群落組成。（B）使用細(xì)菌特異性引物獲得的272個(gè)樣品的細(xì)菌群落組成。（C）使用通用引物獲得的245個(gè)樣品的古菌群落組成和281個(gè)樣品的細(xì)菌群落組成，未顯示少于1,000條序列的樣本。淺藍(lán)色折線圖以對(duì)數(shù)刻度顯示沉積物深度。

2、海洋沉積物中微生物群落與海水和表層土壤土微生物群落的比較

為了評(píng)估海洋沉積微生物群落與其他主要環(huán)境中微生物群落的關(guān)系，作者將海洋沉積物通用引物與使用相同通用引物的引物進(jìn)行微生物群落分析的海水和表層土壤的已發(fā)表序列進(jìn)行了比較。本研究中這三種生態(tài)環(huán)境的微生物群落中的細(xì)菌和古菌群落組成明顯不同（圖4）。如圖3所示，Crenarchaeota和Asgardaeota在海洋沉積物中占優(yōu)勢(shì)，而Euryarchaeota和Thaumarchaeota在海水中占優(yōu)勢(shì)，而Thaumarchaeota在表層土壤中占優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌群落組成表明變形桿菌在表層土壤和海洋中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。此外，Cyanobacteria，Marinimicrobia和Bacteroidetes在海水中占主導(dǎo)地位，而Acidobacteria和Verrucomicrobia在表層土壤中更為重要。在海洋沉積物中普遍存在著Atribacteria和Aerophobetes，但其他兩個(gè)環(huán)境中卻沒(méi)有這些細(xì)菌，這表明海洋沉積微生物構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)特的生物群落。ASV組成的樣品間相似性表明這三個(gè)生物群落中的群落不同（圖4B），海洋沉積物中樣品間的多樣性更高。與其他環(huán)境相比，這種高多樣性可能反映了海洋沉積物棲息地條件的劇烈變化。

圖4 比較海洋沉積物、海水和表層土壤的微生物群落組成。（A）使用16S rRNA通用引物獲得的古菌和細(xì)菌群落組成。（B）使用從ASV中獲得的Jaccard相似性指數(shù)值生成的NMDS排序圖。

3、限制海洋沉積物中微生物群落組成的環(huán)境因素

為了了解哪些環(huán)境因素在全球范圍內(nèi)和廣泛的沉積物深度范圍內(nèi)限制了微生物群落組成，作者對(duì)群落組成和各種環(huán)境特性進(jìn)行了非度量多維尺度分析（NMDS）。這些環(huán)境屬性包括水深、沉積物深度、硫酸鹽濃度、總有機(jī)碳濃度以及是否存在溶解氧。全球范圍內(nèi)海洋沉積物古菌群落可分為兩大類(lèi)：需氧開(kāi)放性海洋類(lèi)和生存于富含有機(jī)物生境的厭氧類(lèi)。細(xì)菌群落類(lèi)似地分為有氧和厭氧的類(lèi)群，它們生活在大陸邊緣和其他上升流區(qū)域（圖5B）。缺乏溶解氧和高濃度的有機(jī)質(zhì)顯著促進(jìn)了海洋沉積微生物群落的物種分類(lèi)組成，從而促進(jìn)了好氧和厭氧海洋沉積微生物生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)功能。NMDA排序結(jié)果結(jié)果表明沉積物深度可能與群落組成獨(dú)立相關(guān)。這種關(guān)系可能是由于隨著沉積物深度的增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量基質(zhì)的可用性降低。
為了檢查地理距離和沉積物巖性與微生物群落組成之間的相關(guān)性，作者對(duì)每個(gè)站點(diǎn)的群落組合進(jìn)行了Mantel測(cè)試。地理距離與群落組成之間的正相關(guān)性相對(duì)較弱，沉積物巖性與群落組成密切相關(guān)。這種強(qiáng)相關(guān)性可能是由于沉積物來(lái)源和沉積速率不同而導(dǎo)致的不同沉積巖性中有機(jī)物的數(shù)量和組成不同所致。對(duì)于單個(gè)沉積物樣品，沉積速率和沉積物年齡也可能是群落組成的重要決定因素。

圖5 海洋沉積物微生物群落的β多樣性。（A–C）使用Jaccard相似性指數(shù)值生成的古菌（A），細(xì)菌（B）和通用引物數(shù)據(jù)集的NMDS排序圖。紫色箭頭表示與特征為P <0.01的環(huán)境因子相符的向量。（D–F）基于Jaccard相似性指數(shù)值，分別對(duì)40個(gè)地點(diǎn)的古菌（D），細(xì)菌（E）和通用引物數(shù)據(jù)集（F）進(jìn)行算術(shù)平均（UPGMA）樹(shù)狀圖的非加權(quán)成對(duì)分組法。（G）基于40處沉積物的礦物成分的UPGMA巖性樹(shù)狀圖。（H）確定地理距離或巖性是否與微生物群落組成相關(guān)。

4、海洋沉積物中微生物群落組成的網(wǎng)絡(luò)分析

為了確定共現(xiàn)模式，作者基于使用通用引物獲得的ASV的Spearman相關(guān)性進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)分析（r> 0.6，P <0.05；圖6）。生成的網(wǎng)絡(luò)圖包含1,533個(gè)節(jié)點(diǎn)（ASV），網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度很高（0.84）。在圖6B中，僅顯示了10個(gè)最大的模塊，其中5個(gè)群落在有氧環(huán)境中普遍存在的模塊（群落1、5、8、9和10）和五個(gè)在缺氧沉積物中普遍存在的ASV組成的模塊（群落2、3、4、6和7）。在這10個(gè)群落中，群落1包含最多數(shù)量的ASV（84個(gè)ASV），主要由Chloroflexi、Proteobacteria和Thaumarchaeota組成（圖6C）。網(wǎng)絡(luò)圖顯示，Chloroflexi和Thaumarchaeota是共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的重要成員（圖6A）。在五個(gè)缺氧沉積物群落中，群落3主要由Atribacteria、Chloroflexi和Planctomyces組成。網(wǎng)絡(luò)分析表明Chloroflexi是海洋沉積物環(huán)境中重要的微生物組成。但是，幾乎所有Chloroflexi都與MSBL9相關(guān)聯(lián)，有報(bào)道表明MSBL9適合利用多種復(fù)雜的糖聚合物。簡(jiǎn)而言之，共生網(wǎng)絡(luò)分析表明，海洋沉積物微生物群落組成受沉積物中氧化還原態(tài)和電子供體的影響。該分析結(jié)果還表明，海底沉積微生物彼此相互作用，以有效利用這種極端環(huán)境中可用的有限基質(zhì)。

圖6 共存的ASV網(wǎng)絡(luò)分析。節(jié)點(diǎn)大小與PageRank成正比。

5、海洋沉積物中微生物群落豐富度的深度變化規(guī)律

為了估計(jì)每個(gè)樣品的分類(lèi)學(xué)豐富度，從樣品的序列數(shù)據(jù)中隨機(jī)抽取1,000條序列，并用于計(jì)算樣本的ASV豐富度（Chao1）。細(xì)菌ASV和古菌ASV豐富度都隨著缺氧沉積物深度的增加而降低（圖7）。但是，在含氧沉積物中，細(xì)菌的豐富度通常隨深度的增加而降低，而古菌的豐富度在整個(gè)沉積物柱中都保持相對(duì)恒定。細(xì)菌豐富度比古菌豐富度高10倍，缺氧沉積物也比含氧沉積物高（圖7B），這可能是因?yàn)楦缓袡C(jī)物的缺氧沉積物通常比缺乏有機(jī)物的含氧沉積物具有更高的微生物豐度。通常，與深度相關(guān)的豐富度下降的陡度與淺層沉積物中群落的豐富度成正相關(guān)。例如，基于缺氧沉積物中ASV豐富度和沉積物深度的回歸線的斜率比含氧沉積物中的曲線陡峭（圖7 A–C），與含氧沉積物相比，無(wú)氧沉積物中較小的初始豐富度在海底選擇壓力下得以生存。類(lèi)似地，在缺氧和含氧沉積物中，隨著沉積物深度的增加，古菌的富度下降不如細(xì)菌富度大。古菌豐富度隨深度降低的程度較低，這與古菌類(lèi)群比細(xì)菌類(lèi)群對(duì)低能量可利用性的一般耐受性有關(guān)。然而，盡管古菌豐富度隨沉積物深度降低的速率較低，但在所有沉積物深度，古菌豐富度通常都低于細(xì)菌豐富度。

圖7 含氧海洋沉積物和缺氧海洋沉積物中微生物豐富度的深度分布。

6、海洋沉積物中微生物群落的總分類(lèi)學(xué)豐富度
作者使用了三組16SrRNA基因序列文庫(kù)（古菌，細(xì)菌和Universal）來(lái)估計(jì)海洋沉積物中ASV的數(shù)量。為了確保作者的結(jié)果的可信性，作者同時(shí)利用以上五種SAR方法估計(jì)了其他生境中古菌和細(xì)菌多樣性，包括表層土（topsoil）、海水（seawater）、海底（subseafloor）和海洋（ocean），結(jié)果可作為參考數(shù)據(jù)使用，發(fā)現(xiàn)測(cè)序深度和是否去除污染物對(duì)使用SAR方法估計(jì)多樣性差別不大。
在這五個(gè)模型中， AIC得分表明，asymptotic模型和Gitay模型對(duì)于這三個(gè)數(shù)據(jù)集而言是最佳和次佳的。如果將其外推到海洋沉積物的總量，則使用asymptotic模型時(shí)古菌ASV的總數(shù)為7.85×103，而使用Gitay模型時(shí)則為6.10×105。使用asymptotic模型，全球海洋沉積物中細(xì)菌ASV的總數(shù)為3.28×104，而使用Gitay模型，則為2.46×106。在這兩個(gè)模型中，細(xì)菌豐富度大約比古菌豐富度高四倍。對(duì)于古菌，模型外推的范圍是6.18×103至7.90×1015，對(duì)于細(xì)菌ASV，模型外推的范圍是2.88×104至1.32×1015。使用通用數(shù)據(jù)集估算全球多樣性，作者再次發(fā)現(xiàn)asymptotic模型是最佳模型，古菌和細(xì)菌的多樣性分別為1.98×103和3.90×104。該結(jié)果與上述細(xì)菌和古菌數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致。使用asymptotic模型和Gitay模型進(jìn)行的估算遠(yuǎn)低于先前對(duì)地下地下生物群落中微生物分類(lèi)學(xué)豐富度的估算（即109至1012）。作者認(rèn)為使用Arrhenius模型計(jì)算的全局ASV值是一個(gè)很大的高估。

總結(jié)

在本研究中，作者調(diào)查了來(lái)自全球分布的40個(gè)不同地點(diǎn)，共299個(gè)沉積物巖芯樣品。這些樣品位于海底以下0.1-678米的深度位置，通過(guò)高通量測(cè)序共獲得超過(guò)4700萬(wàn)條16S rRNA基因序列，較大的測(cè)序深度使得所有樣本之間能夠互相進(jìn)行準(zhǔn)確的比較。
統(tǒng)計(jì)分析表明，物種分類(lèi)組成、沉積有機(jī)碳濃度和溶解氧之間存在顯著的相關(guān)性。物種-區(qū)域擬合關(guān)系模型發(fā)現(xiàn)海洋沉積物中古菌和細(xì)菌的物種豐富度分別為7.85×103~6.10×105和3.28×104~2.46×106，表明海洋沉積物中微生物的豐度大小可以與表層土壤和海水的物種豐富度相媲美。