合作文章|Nat Cell Biol|線粒體定位的ZNFX1充當(dāng)dsRNA傳感器通過(guò)MAVS啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)

2019年11月2日Nat Cell Biol雜志在線發(fā)表了題為“Mitochondria-localised ZNFX1 functions as a dsRNA sensor to initiate antiviral responses through MAVS”的文章，該文章由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐安龍教授團(tuán)隊(duì)完成，其中RNA-seq部分由百邁客協(xié)助完成，詳細(xì)情況如下：

英文題目：Mitochondria-localised ZNFX1 functions as a dsRNA sensor to initiate antiviral responses through MAVS

中文題目：線粒體定位的ZNFX1充當(dāng)dsRNA傳感器通過(guò)MAVS啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)

發(fā)表雜志：Nature Cell Biology，2019

影響因子：17.728

合作單位：中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

小編悄悄告訴您，近期百邁客醫(yī)學(xué)的高分合作文章不少，趁著年前陸續(xù)解讀給各位fans，咱們也看看人家是如何設(shè)計(jì)文章思路的。

 

研究背景

過(guò)去的二十年的研究表明，屬于解旋酶超家族2（SF2）的DExD/H-bo解旋酶在抗病毒先天免疫中起著至關(guān)重要的作用。但是，與SF2共享一個(gè)保守的解旋酶核心(兩個(gè)串聯(lián)的RecA域組成，具有ATPase活性和RNA結(jié)合能力)的解旋酶SF1的抗病毒功能鮮為人知。

病毒衍生的核酸與胞質(zhì)病毒傳感器結(jié)合后，可以募集兩個(gè)配體MAVS和STING來(lái)誘導(dǎo)I型干擾素(IFN)的產(chǎn)生以及許多具有抗病毒活性的干擾素刺激基因（ Interferon Stimulated Genes,ISG）。這些ISGs在多種抗病毒免疫水平上發(fā)揮著多種功能，比如ISGs可抑制特定的病毒生命周期階段，此外，某些ISGs還可以增強(qiáng)先天病原體的識(shí)別能力或積極調(diào)節(jié)IFN信號(hào)傳導(dǎo)。

研究目的：

確定很少研究的解旋酶SF1的抗病毒功能并鑒定更多ISGs。

研究方法

已發(fā)表數(shù)據(jù)重新挖掘：水皰性口炎病毒（VSV）感染的人單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞（MDM）的IVT-SAPAS（in vitro transcription-sequencing alternative polyadenylation sites）時(shí)間梯度數(shù)據(jù)，篩選新的可能基因–包含ZNFX1。
關(guān)鍵基因抗病毒作用驗(yàn)證：1）敲減關(guān)鍵基因表達(dá)，VSV-eGFP感染檢測(cè)這些基因的抗病毒活性–初步證實(shí)ZNFX1參與抗病毒反應(yīng)；2）qRT-PCR或免疫印跡分析VSV感染或干擾素誘導(dǎo)劑聚肌胞苷酸(poly(I:C))刺激各細(xì)胞系或小鼠后組織中ZNFX1表達(dá)改變；3）病毒感染公共數(shù)據(jù)挖掘，感染后ZNFX1表達(dá)上調(diào)；

ZNFX1為干擾素刺激基因ISG驗(yàn)證：人重組IFN-α和IFN-β孵育實(shí)驗(yàn)、JAK1抑制劑魯索替尼(ruxolitinib)、Ifnar1敲除后qRT-PCR和免疫印跡分析ZNFX1表達(dá)水平；轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)及轉(zhuǎn)錄因子motif缺失和WT報(bào)告基因試驗(yàn)證實(shí)其病毒感染后的上調(diào)取決于JAK1-STAT1級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

體外和在體實(shí)驗(yàn)證明ZNFX1抗RNA病毒天然免疫調(diào)控作用：A549、L929細(xì)胞、293T細(xì)胞、小鼠等siRNA沉默或Crispr-cas9敲除VSV感染實(shí)驗(yàn)，ZNFX1過(guò)表達(dá)和對(duì)照組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析其影響的信號(hào)通路。

ZNFX1與IFN信號(hào)傳導(dǎo)：ZNFX1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和Ifnb1-reporter或IFN刺激的應(yīng)答元件（ISRE）報(bào)告質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因分析，然后進(jìn)行或不進(jìn)行VSV感染，等實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZNFX1通過(guò)誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生而參與抗病毒免疫反應(yīng)，其抗病毒特性也取決于IFN信號(hào)傳導(dǎo)。

ZNFX1與病毒RNA結(jié)合：pulldown實(shí)驗(yàn)和RIP-seq等；

ZNFX1線粒體定位以及互作的IFN產(chǎn)生相關(guān)adaptor分析：不同組分分離WB、顯微共聚焦實(shí)驗(yàn)、Co-IP實(shí)驗(yàn)、線粒體組分分離及蛋白酶保護(hù)測(cè)定等；poly(I:C)處理與否的Rig-I-/-A549細(xì)胞RNA-seq，空載EV、ZNFX1過(guò)表達(dá)、EV+poly(I:C)、ZNFX1+poly(I:C)，共計(jì)4組；等

 

研究結(jié)果

1、病毒感染誘導(dǎo)ZNFX1表達(dá)

作者首先分析了他們先前發(fā)表的被水皰性口炎病毒（VSV）感染的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞（MDM）的IVT-SAPAS（in vitro transcription-sequencing alternative polyadenylation sites）數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)了許多表達(dá)改變的基因?！局耙寻l(fā)表文章的數(shù)據(jù)重新挖掘】通過(guò)比較受VSV感染的人MDM數(shù)據(jù)和小鼠腹膜巨噬細(xì)胞數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一些共同的基因，它們被上調(diào)了三倍以上，包括FFAR2，ZEB2，TIPAP，PTGS2，CMPK2，ZNFX1和CSRNP1。隨后敲除A549細(xì)胞中的這些基因，用VSV-eGFP（VSV-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）感染細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比表明，敲減ZNFX1（其抗病毒作用尚未見(jiàn)報(bào)道）促進(jìn)了VSV感染。

補(bǔ)充圖1

研究表明，屬于RNA解旋酶SF2的DExD/H-box RNA解旋酶在抗病毒免疫反應(yīng)中起著多種作用。ZNFX1是RNA解旋酶SF1的代表，它包含一個(gè)ARM(Armadillo-type fold)域、一個(gè)P環(huán)解旋酶域和一個(gè)鋅指（ZF）域。因?yàn)閬?lái)自解旋酶SF1和SF2的基因共享一個(gè)保守的核心結(jié)構(gòu)，以兩個(gè)串聯(lián)的RecA域?yàn)樘卣鳎宰髡哒J(rèn)為SF1也可能在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。

為驗(yàn)證假設(shè)，作者使用IVT-SAPAS數(shù)據(jù)分析了SF1和SF2的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)亞家族中的許多基因在VSV感染后表達(dá)都有變化（圖1a）。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，敲低A549細(xì)胞中的MOV10、HELZ2、UPF1和ZNFX1導(dǎo)致VSV復(fù)制明顯增強(qiáng)，而敲除SEXT引起相反的結(jié)果。MOV10、UPF1和SEXT以前被報(bào)道與抗病毒免疫有關(guān)，驗(yàn)證了基于RNAi和病毒感染的篩選方法有效，并暗示ZNFX1可能是未發(fā)現(xiàn)的抗病毒分子。

為了更深入地了解ZNFX1在抗病毒應(yīng)答中的作用，進(jìn)行了qRT-PCR或免疫印跡分析，以了解VSV感染或干擾素誘導(dǎo)劑聚肌胞苷酸(poly(I:C))刺激A549細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）細(xì)胞后ZNFX1的表達(dá)上調(diào)（圖1b–d）。qRT-PCR也證實(shí)了靜脈注射VSV后小鼠脾臟和肺中Znfx1的豐度上調(diào)（包括胸腺、淋巴結(jié)脾臟和肺）（圖1e）。作者還對(duì)先前收集的芯片數(shù)據(jù)集（GDS4231/4214/1271/3210/6082/6063）進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，在HIV感染患者和猿猴免疫缺陷病毒（SIV）引起的腦炎猴子中，Znfx1的RNA水平明顯更高（圖1f,g）。此外，在不同的細(xì)胞類型（包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞）中感染病毒后，Znfx1的轉(zhuǎn)錄顯著增加。這些數(shù)據(jù)都表明ZNFX1可能是抗病毒分子。

圖1_上

2、ZNFX1是干擾素刺激基因ISG

由于病毒感染導(dǎo)致ZNFX1的mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)均增強(qiáng)，接下來(lái)通過(guò)將A549細(xì)胞與人重組IFN-α和IFN-β一起孵育來(lái)檢測(cè)ZNFX1是否為ISG。qRT-PCR和免疫印跡分析的結(jié)果表明ZNFX1的表達(dá)可以被IFN-α和IFN-β誘導(dǎo)（圖1h,i）。相比之下，JAK1抑制劑魯索替尼(ruxolitinib)可以抑制VSV對(duì)Znfx1 mRNA的誘導(dǎo)，并且在Ifnar1-/-A549細(xì)胞中幾乎消失（圖1j,k）。

圖1_下

為了確定哪些核苷酸和區(qū)域Znfx1轉(zhuǎn)錄中很重要，使用promoter 2.0（ http://www.cbs.dtu.dk/services/promoter/）、JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）和CpGplot（http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/）進(jìn)行識(shí)別，其中包含TATA框、GC框和CAAT框的Znfx1的-1,064~+63之間的區(qū)域，是啟動(dòng)子。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的進(jìn)一步分析表明，Znfx1的啟動(dòng)子在相對(duì)集中和重疊的區(qū)域中包含STAT1、STAT2、IRF1和IRF9結(jié)合基序。基于這些分析，構(gòu)建了一個(gè)Znfx1啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，包含?1,064~+63之間的區(qū)域，以及一個(gè)突變的報(bào)告基因構(gòu)建體，其中缺失了STAT1、STAT2、IRF1和IRF9結(jié)合motif。接下來(lái)，STAT1，STAT2，IRF1或IRF9過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和2個(gè)報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，報(bào)告基因分析表明，在STAT1、STAT2、IRF1或IRF9存在的情況下，報(bào)告基因的表達(dá)可以由Znfx1啟動(dòng)子誘導(dǎo)，而不能由缺少轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子載體誘導(dǎo)（圖1l）。總而言之，ZNFX1是一個(gè)ISG，其病毒感染后的上調(diào)取決于JAK1-STAT1級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

3、ZNFX1對(duì)于抗RNA病毒天然免疫至關(guān)重要

為了進(jìn)一步探討ZNFX1在抗病毒免疫反應(yīng)中的作用，作者沉默了A549和L929細(xì)胞中ZNFX1的內(nèi)源性表達(dá)，用VSV-eGFP感染，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果表明，Znfx1的敲低顯著增強(qiáng)了A549和L929細(xì)胞中的VSV復(fù)制（圖2a）。同時(shí)，在Znfx1沉默細(xì)胞中觀察到更高的VSV滴度和增加的VSV-G蛋白（圖2b,c）。一致地，在VSV感染或poly(I:C)刺激后，敲低Znfx1表達(dá)可顯著降低A549細(xì)胞中IFN-α和IFN-β蛋白的產(chǎn)生。相反，當(dāng)ZNFX1過(guò)表達(dá)時(shí)，在A549細(xì)胞中觀察到了較低的VSV mRNA和VSV滴度。

為了獲得ZNFX1在抗病毒反應(yīng)中的更多功能證據(jù)，采CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯方法敲除293T和A549細(xì)胞中的Znfx1。同樣發(fā)現(xiàn)293T和A549細(xì)胞中敲除Znfx1增強(qiáng)了VSV復(fù)制（圖2d）。同時(shí)，在野生型或Znfx1-/-A549細(xì)胞中ZNFX1的過(guò)表達(dá)限制了VSV復(fù)制（圖2e）。進(jìn)一步的RNA-seq分析比較了野生型對(duì)照和ZNFX1過(guò)表達(dá)的A549細(xì)胞之間差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示參與病毒復(fù)制和I型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控的上調(diào)基因顯著富集（圖2f）。有趣的是，在腦心肌炎病毒EMCV和甲型流感病毒（H1N1）感染的Znfx1敲低的A549細(xì)胞中，病毒mRNA水平升高，但在單純皰疹病毒1型（HSV-1）感染后并未顯著改變，表明ZNFX1具有廣泛的抗RNA病毒譜 。

圖2_上

為了研究ZNFX1在體內(nèi)的生理作用，使用CRISPR/Cas系統(tǒng)生成了Znfx1-/-C57BL/6J小鼠。Znfx1-/-小鼠存活，沒(méi)有明顯的生理或行為異常。在這項(xiàng)研究中使用了六至八周大的小鼠。首先，分離野生型和Znfx1-/-小鼠的BMDM并用VSV、EMCV、H1N1或HSV-1感染，與野生型相比，Znfx1-/-BMDM的IFN-α或IFN-β分泌較低。RNA病毒感染后，包括VSV、EMCV和H1N1，但不包括HSV-1（圖2g），Znfx1-/-BMDM中檢測(cè)到較高的病毒mRNA水平，但在HSV-1感染的細(xì)胞中未檢測(cè)到較高的病毒mRNA水平（圖2h）。與野生型相比，Znfx1-/- MEF和A549細(xì)胞在RNA病毒感染VSV和EMCV后表現(xiàn)出較低的IFN-β分泌（圖2i,j）。

圖2_下

ZNFX1在宿主體內(nèi)對(duì)抗病毒感染的防御中的重要性：通過(guò)尾靜脈向野生型和Znfx1-/-小鼠注射了VSV。與野生型小鼠相比，Znfx1-/-小鼠的肺和肝中的VSV復(fù)制增強(qiáng)了（圖3a），隨著肺和肝中Ifnb1表達(dá)的減少，在Znfx1-/-小鼠中血清中IFN-α和IFN-β的分泌降低（圖3b，c）。而HSV-1感染后，Znfx1-/-和野生型小鼠之間血清中的IFN-α和IFN-β沒(méi)有差異（圖3c）。有趣的是，VSV感染一天后，Znfx1-/-小鼠中有80％患有結(jié)膜炎，這是VSV感染的早期癥狀（圖3d）。另外，觀察到VSV感染后炎性細(xì)胞更多地滲透到Znfx1-/-小鼠的肺中（圖3e），并且Znfx1-/-小鼠在存活試驗(yàn)中對(duì)VSV感染的抵抗力較弱（圖3f）。這些數(shù)據(jù)表明，Znfx1缺乏后體內(nèi)產(chǎn)生較少的I型IFN，削弱了針對(duì)RNA病毒感染的先天免疫反應(yīng)?？傊?，ZNFX1專門(mén)針對(duì)RNA病毒發(fā)揮其抗病毒特性。

圖3

4、ZNFX1啟動(dòng)基于IFN的抗病毒反應(yīng)

為了研究ZNFX1在IFN信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，通過(guò)ZNFX1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和Ifnb1-reporter或IFN刺激的應(yīng)答元件（ISRE）報(bào)告質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因分析，然后進(jìn)行或不進(jìn)行VSV感染。結(jié)果表明，ZNFX1的過(guò)表達(dá)輕微激活了Ifnb1啟動(dòng)子和ISRE報(bào)告基因（圖4a）。此外，ZNFX1以劑量依賴的方式顯著增強(qiáng)了由VSV、2種類型的poly(I:C)或poly(dA:dT)觸發(fā)的Ifnb1啟動(dòng)子激活（圖4b,c）。相反，敲除Znfx1可降低VSV誘導(dǎo)的293T細(xì)胞中Ifnb1報(bào)告基因和ISRE報(bào)告基因的激活（圖4d）。Ifnb1和ISGs的轉(zhuǎn)錄以劑量和時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)（圖4e），當(dāng)ZNFX1在A549細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)隨著劑量和時(shí)間增強(qiáng)反之敲除ZNFX1則降低。而與野生型細(xì)胞相比，Znfx1-/-A549和MEF細(xì)胞中ISG蛋白表達(dá)量分別減少（圖4f）。VSV感染后Znfx1-/-巨噬細(xì)胞中TBK1和IRF3的磷酸化低于野生型巨噬細(xì)胞（圖4g）。在VSV感染的Znfx1-/-293T細(xì)胞中，IRF3的二聚化也低于野生型細(xì)胞（圖4h）。野生型A549細(xì)胞中觀察到了VSV的限制性復(fù)制，但在Ifnar1-/-A549細(xì)胞中未觀察到（圖4i）。所有這些數(shù)據(jù)表明，ZNFX1通過(guò)誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生而參與抗病毒免疫反應(yīng)，其抗病毒特性也取決于IFN信號(hào)傳導(dǎo)。

圖4

5、ZNFX1直接結(jié)合病毒RNA

屬于RNA解旋酶SF2的許多基因被鑒定為結(jié)合病毒RNA的RNA病毒傳感器，因此假設(shè)屬于SF1的ZNFX1也可能作為RNA傳感器結(jié)合病毒RNA。為證實(shí)這一假設(shè)，首先在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ZNFX1，然后進(jìn)行pulldown和qRT-PCR分析以確定ZNFX1與VSV-RNA的高結(jié)合能力（圖5a,b）。也檢測(cè)了內(nèi)源性ZNFX1與A549細(xì)胞中的VSV，EMCV和仙臺(tái)病毒（SeV）RNA的結(jié)合能力（圖5c）。通過(guò)用抗內(nèi)源性ZNFX1的抗體從免疫沉淀物中分離RNA來(lái)進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP）測(cè)序分析，將ZNFX1相關(guān)的RNA比對(duì)到VSV基因組（圖5d），優(yōu)先定位于約6,000-8,000 nt的VSV片段（圖5e）。值得注意的是，當(dāng)與ZNFX1相關(guān)的RNA轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中時(shí)，通過(guò)qRT-PCR和熒光素酶活性分析觀察到了Ifnb1的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和基于Ifnb1啟動(dòng)子的報(bào)告基因的誘導(dǎo)表達(dá)（圖5f）。

為了進(jìn)一步評(píng)估與ZNFX1結(jié)合的病毒RNA的性質(zhì)，首先將核酸類似物連接的磁珠與經(jīng)Flag標(biāo)記的ZNFX1、RIG-I或MAVS過(guò)表達(dá)的293T細(xì)胞裂解液一起孵育，并進(jìn)行了pulldown試驗(yàn)以顯示ZNFX1和RIG-I蛋白與poly(I:C)結(jié)合，但不與poly(C)結(jié)合（圖5g）。cGAS而非ZNFX1結(jié)合單鏈和雙鏈DNA（ISD，一個(gè)45 bp的雙鏈DNA；圖5h）。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示ZNFX1蛋白與HMW poly(I:C)優(yōu)先結(jié)合，而不是與LMW poly(I:C)、poly(dA:dT)或5’pppdsRNA優(yōu)先結(jié)合（圖5i）。為了找到ZNFX1的poly(I:C)結(jié)合位點(diǎn)，準(zhǔn)備了ZNFX1的截短版本并進(jìn)行了poly(I:C) pulldown實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，ZNFX1與poly(I:C)的結(jié)合需要ARM域和P環(huán)結(jié)構(gòu)域，而不是ZF鋅指域（圖5j）。病毒感染后ZNFX1的寡聚化增強(qiáng)（圖5k,1）。因此，ZNFX1充當(dāng)RNA病毒傳感器，它傾向于結(jié)合長(zhǎng)RNA分子。

 

圖5

7、ZNFX1定位于線粒體并與MAVS相互作用

為了確定ZNFX1的亞細(xì)胞定位，將受VSV感染的細(xì)胞分為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分，主要在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到ZNFX1蛋白（圖6a）。以前有關(guān)含ARM域的蛋白ALEX3和ARM1的研究表明，這些蛋白是線粒體定位的。因此，通過(guò)免疫印跡分析確定ZNFX1是否也可以定位于該免疫相關(guān)細(xì)胞器上。結(jié)果顯示，從VSV感染的細(xì)胞中分離出的線粒體部分中ZNFX1蛋白量增加（圖6a）。共聚焦顯微鏡證實(shí)過(guò)表達(dá)的ZNFX1蛋白與線粒體共定位，病毒感染后觀察到ZNFX1斑點(diǎn)擴(kuò)大（圖6b）。為了進(jìn)一步探索ZNFX1的線粒體定位，進(jìn)行了蛋白酶保護(hù)測(cè)定。如圖6c所示，當(dāng)用不含Triton X-100的蛋白酶K處理線粒體時(shí)，MAVS和大多數(shù)ZNFX1蛋白被消化，表明ZNFX1是線粒體外膜蛋白。相反，細(xì)胞色素c氧化酶亞基IV（COX IV）是線粒體內(nèi)膜蛋白，對(duì)蛋白酶K消化有抵抗力。進(jìn)一步對(duì)線粒體進(jìn)行堿提取，回收具有外周膜蛋白的上清液和具有完整膜蛋白的沉淀物，發(fā)現(xiàn)外膜整合蛋白MAVS主要在提取后的沉淀中回收，但在2個(gè)餾分中均觀察到了COX IV。ZNFX1在上清液中大量回收（圖6c），表明ZNFX1作為外周膜蛋白定位于線粒體，如先前報(bào)道中的SARM1和ALEX3。

為了進(jìn)一步表征ZNFX1在感測(cè)病毒RNA時(shí)如何轉(zhuǎn)導(dǎo)抗病毒信號(hào)，檢查了ZNFX1與涉及IFN產(chǎn)生的配體（包括TRIF、MyD88，MAVS和STING）的相互作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，帶有HA標(biāo)記的ZNFX1與帶有Flag標(biāo)記的MAVS相關(guān)，但與TRIF、MyD88和STING無(wú)關(guān)（圖6d）。免疫沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，ZNFX1和MAVS在A549細(xì)胞中形成天然復(fù)合物，并且病毒感染后ZNFX1表達(dá)上調(diào)而增強(qiáng)了它們的結(jié)合（圖6e-g）。共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)還表明ZNFX1與MAVS共定位（圖6h）。使用一系列ZNFX1截短突變體進(jìn)行進(jìn)一步的免疫沉淀試驗(yàn)表明，全長(zhǎng)ZNFX1和含ARM的突變體，包括F3和F5，都可以與MAVS相互作用（圖6i）。與共免疫沉淀試驗(yàn)一致，ZNFX1的全長(zhǎng)和F3截短突變體過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了Ifnb1和ISG的誘導(dǎo)表達(dá)以及受限制的VSV復(fù)制（圖6j）。此外，如果沒(méi)有跨膜（TM）域，ZNFX1不能與截短的MAVS相互作用（圖6k），ZNFX1的線粒體分布與其與MAVS的相互作用無(wú)關(guān)。

 

圖6

7、ZNFX1介導(dǎo)的信號(hào)獨(dú)立于RIG-1和MDA5

為了驗(yàn)證ZNFX1在產(chǎn)生獨(dú)立于現(xiàn)有抗病毒傳感器RIG-1和MDA5的抗病毒免疫反應(yīng)中的作用，首先進(jìn)行了共免疫沉淀試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ZNFX1在靜止或受VSV感染的細(xì)胞中既不與RIG-1也不與MDA5相互作用，qRT-PCR分析結(jié)果表明Znfx1缺乏并不影響RIG-1、MDA5和MAVS介導(dǎo)的Ifnb1表達(dá)的誘導(dǎo)（圖7a）。此外，過(guò)表達(dá)的ZNFX1可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)野生型和Mda5-/-細(xì)胞中Ifnb1和Ifit1的mRNA表達(dá)，在Rig-I-/-細(xì)胞中略有誘導(dǎo)，但在Mavs-/-細(xì)胞中則沒(méi)有效果（圖7b）。當(dāng)分別用ZNFX1、RIG-1和MDA5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，Mda5-/-細(xì)胞中VSV和EMCV的病毒載量降低（圖7c）。同樣，F(xiàn)ACS分析表明，VSV-eGFP感染的野生型、Mda5-/-和Rig-I-/-細(xì)胞中的GFP+細(xì)胞百分比降低（7d,e）。通過(guò)進(jìn)行poly(I:C)處理與否的Rig-I-/-A549細(xì)胞RNA-seq，觀察到ZNFX1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了poly(I:C)刺激下Rig-I-/-A549細(xì)胞中IFN和ISG的誘導(dǎo)（圖7f）。分別用ZNFX1或RIG-I過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Znfx1和Rig-I雙敲除細(xì)胞（DKO）中VSV和poly(I:C)誘導(dǎo)的Ifnb1和Ifit1表達(dá)增強(qiáng)（圖7g,h）。此外，ZNFX1的siRNA敲低可以進(jìn)一步增強(qiáng)Rig-I-/-細(xì)胞中VSV-eGFP的病毒載量（圖7i）。DKO細(xì)胞中VSVeGFP的病毒載量遠(yuǎn)高于Rig-I-/-細(xì)胞中的病毒載量（圖7j）。所有這些結(jié)果表明ZNFX1無(wú)需依賴RLR(視黃酸誘導(dǎo)基因/RIG-1樣受體)即可發(fā)揮其抗病毒作用。

 

圖7

小結(jié)

總之，作者分析了先前發(fā)表的水皰性口炎病毒（VSV）感染的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞（MDM）體外轉(zhuǎn)錄-多聚腺苷酸化位點(diǎn)測(cè)序（IVT-SAPAS）數(shù)據(jù)，確定ZNFX1（解旋酶SF1的成員）為ISG和線粒體定位的dsRNA傳感器。ZNFX1可以通過(guò)感測(cè)病毒RNA并與MAVS相互作用而在RNA病毒感染后立即啟動(dòng)IFN和ISG表達(dá)，而無(wú)需依賴RLR(視黃酸誘導(dǎo)基因/RIG-1樣受體)。ZNFX1的鑒定不僅闡明了RNA解旋酶SF1在抗病毒免疫中的功能，而且為抗病毒治療提供了目標(biāo)。

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https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31685995

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