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PART ONE
論文內(nèi)容詳解
威寧黑麥?zhǔn)俏覈脑耘嗪邴溤绯樗雰?yōu)良品種，具有抗白粉病和條銹病的能力。為了解析黑麥優(yōu)良性狀的遺傳和分子基礎(chǔ)，促進(jìn)黑麥及相關(guān)作物的基因組和育種研究，作者對威寧黑麥進(jìn)行了基因組測序和分析。
- 基因組裝與注釋
- 轉(zhuǎn)座子分析
- 黑麥基因組進(jìn)化和染色體共線性研究
- 基因重復(fù)及其對淀粉生物合成基因的影響分析
- 黑麥種子貯藏蛋白(SSP)基因位點的解析
- 轉(zhuǎn)錄因子(TF)及抗病基因的注釋和分析
- 早抽穗性狀相關(guān)基因表達(dá)特征的研究
- 黑麥馴化過程中染色體區(qū)域和基因座的挖掘
流式預(yù)估黑麥基因組大小約為7.86 Gb，結(jié)合PacBio、Illumina、Hi-C、遺傳圖譜、BioNano光學(xué)圖譜等技術(shù)進(jìn)行基因組組裝。最終組裝7.74 Gb基因組（為預(yù)估基因組大小的98.47%），scaffold N50 為1.04 Gb，并將93.67%的序列掛載至7條染色體上（圖1）。黑麥中每條染色體基因組大小均在1G左右（2R、3R、4R、6R、7R（~1Gb）；1R（0.94097 Gb）、5R（0.99891 Gb) ），比烏拉爾圖小麥（T. urartu；Tu；AA型）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii；Aet；DD型）、野生二粒小麥（T. turgidum?ssp. dicoccoides；WEW；AABB型）、普通小麥（Ta）和大麥（Hv）等復(fù)雜的麥類中的單條染色體基因組均要大。超大的基因組及染色體，對黑麥基因組組裝，特別是染色體掛載帶來了巨大的挑戰(zhàn)。
將組裝結(jié)果與兩個冬季黑麥品種（Lo7和Lo225）構(gòu)建的染色體連鎖圖相比，威寧黑麥1R至7R物理圖具有較高的一致性。在先前報道的Lo7的pyro-sequencing reads中97.45%可以定位到威寧基因組，平均序列同源性為97.71%，平均序列覆蓋率為97.27%。LAI值為18.42，遠(yuǎn)高于先前發(fā)表的小麥和大麥基因組的LAI值。BUSCO評估結(jié)果為96.74%。并注釋了86,991個蛋白編碼基因。盡管黑麥基因組非常復(fù)雜，通過以上評估結(jié)果說明，本次研究構(gòu)建了一個高質(zhì)量的威寧黑麥基因組。
圖1 黑麥基因組特征
威寧黑麥基因組中90.31%被注釋為轉(zhuǎn)座子（TE），共包含537個家族的2,671,941個成員，這些TE的含量明顯比普通小麥 (84.70%), 烏拉爾圖小麥 (81.42%), 節(jié)節(jié)麥 (84.40%), 野生二粒小麥 (82.20%)以及大麥 (80.80%)更高。其中長末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR-RTs）是主要的轉(zhuǎn)座子，在注釋的TEs中占 84.49%。
與烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥及大麥的LTR-RTs進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：（1）Gypsy是威寧黑麥基因組擴(kuò)張的主要原因之一(Fig. 2a)，并且有3個LTR-RT家族（Daniela, Sumaya, Sumana）在威寧黑麥中特異擴(kuò)張，其中Daniela的占比最高 (Fig. 2b)。（2）威寧黑麥中完整的LTR-RTs插入時間存在獨特的雙峰分布(Fig. 2c)，最近一個擴(kuò)增峰出現(xiàn)在50萬年前，另出現(xiàn)在1.7 百萬年（MYA）左右（與大麥相同） (Fig. 2c)。（3）這種雙峰分布模式由Gypsy?RTs的擴(kuò)增主導(dǎo)(Fig. 2d)。
圖2 黑麥中轉(zhuǎn)座子分析
通過比較威寧黑麥、烏拉爾圖小麥、節(jié)節(jié)麥、普通小麥（亞基因組TaA、TaB和TaD）、大麥、水稻Os（Oryza sativa ssp.?japonica）、二穗短柄草Bd（Brachypodium distachyon）、玉米Zm（Zea mays）、高粱Sb（Sorghum bicolor）、谷子Si（Setaria italica）基因組，共找到2517個單拷貝同源基因。通過對單拷貝基因組構(gòu)建進(jìn)化樹和計算分化時間發(fā)現(xiàn)，在大麥和小麥分化后（15MYA）黑麥和二倍體小麥發(fā)生了分化（9.6 MYA） (Fig. 3a)。
作者以水稻為祖先參考基因組，研究了威寧黑麥的染色體進(jìn)化。威寧黑麥與水稻共鑒定出23個大的共線性區(qū)，包含10949對同源基因，可推斷出祖先染色體片段在1R到7R之間的排列（圖3b）：（1）3R來源于一條古老的染色體AGK1/Os1，該染色體的一段易位到6RL；（2）1R和2R分別由兩條祖先染色體組成，1R與AGK10/Os10嵌套插入AGK5/Os5有關(guān)，2R與AGK7/Os7嵌套插入AGK4/Os4有關(guān)；（3）4R, 5R, 6R,7R是通過復(fù)雜易位從至少三條祖先染色體上獲得的（圖3b）。
在威寧黑麥基因組與普通小麥3個亞基因組的比較中，1R、2R和3R分別與小麥1、2和3組染色體完全共線。在4R中發(fā)現(xiàn)與4A/4B/4D、7A/7B/7D或6A/6B/6D部分共線性的三個區(qū)域。5R與5A完全共線，與5B、5D部分共線是由于易位的4B或4D片段在5BL或5DL的長臂融合（圖3c）。在6R中，觀察到3個區(qū)域與6A/6B/6D、3A/3B/3D或7A/7B/7D部分共線。這些數(shù)據(jù)將有助于黑麥在禾本科比較基因組學(xué)研究以及黑麥與普通小麥雜交研究中的應(yīng)用。
圖3 黑麥基因組進(jìn)化及染色體共線性分析
作者在威寧黑麥中檢測到4217個單拷貝基因、23753個分散重復(fù)基因 (DDGs)、6659個近端重復(fù)基因 (PDGs)、7077個串聯(lián)重復(fù)基因(TDGs)和1866個片段重復(fù)基因。轉(zhuǎn)座重復(fù)基因（TrDGs）由TE活性誘導(dǎo)的，它們是DDGs的主要組成部分。作者以大麥為參考，在威寧黑麥中鑒定出10357個TrDG，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于以相同方式計算的烏拉爾圖小麥（7145）和節(jié)節(jié)麥（7351）中TrDG的數(shù)量（圖4b）。威寧黑麥所特有的TrDG（5926）也比烏拉爾圖小麥（3513）和節(jié)節(jié)麥（3327）所特有的TrDG更多（圖4b）。
接下來作者研究了黑麥淀粉生物合成相關(guān)基因（SBRGs）中的基因復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)類型在黑麥淀粉生物合成相關(guān)基因（SBRGs）中普遍存在，并且不同的SBRG的復(fù)制基因之間往往表現(xiàn)出表達(dá)差異，說明不同類型的基因復(fù)制可以豐富黑麥基因在重要生物過程中的遺傳多樣性（圖4c），這些黑麥SBRGs的新變化可能為調(diào)控植物淀粉生物合成和性質(zhì)提供新的酶活性，因此解析全套黑麥SBRGs有利于提高黑麥的產(chǎn)量潛力和營養(yǎng)品質(zhì)。
?圖4 黑麥基因重復(fù)及其對淀粉合成相關(guān)基因多樣性的影響
與小麥和大麥相似，黑麥在胚乳組織中積累了豐富的儲存蛋白SSPs。作者利用威寧基因組組裝技術(shù)對黑麥SSP基因座進(jìn)行了分析。
在威寧黑麥中未發(fā)現(xiàn)小麥低分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GSs）或大麥B-hordein的同源序列（圖5b），表明在黑麥進(jìn)化過程中攜帶這些基因的染色體片段缺失，這可能是1BL1RS易位系小麥品種中，品質(zhì)受影響的主要原因。并且在威寧黑麥基因組中未發(fā)現(xiàn)α-醇溶蛋白基因，這說明小麥及其近緣種的α-醇溶蛋白（α-gliadin）基因可能在小麥和黑麥分化之后進(jìn)化產(chǎn)生的。這些SSP分析結(jié)果闡明了黑麥堿基因座的結(jié)構(gòu)和組成，這將有助于進(jìn)一步研究黑麥、小黑麥和小麥的加工和營養(yǎng)品質(zhì)。
圖5 黑麥堿位點分析
作者利用iTAK預(yù)測了威寧黑麥和其他8種禾本科植物的TF基因，在注釋的65個轉(zhuǎn)錄因子基因家族中，威寧黑麥有28個家族成員增加，其中AP2/ERF TF基因家族成員增加幅度較大。威寧黑麥的抗病相關(guān)基因（DRA）數(shù)量（1989）比烏拉爾圖小麥（1621）、節(jié)節(jié)麥（1758）、大麥（1508）、二穗短柄草（1178）、水稻（1575）以及普通小麥的A（1836）、B（1728）和D（1888）亞基因組多。鑒于AP2/ERF TFs和DRA基因在植物對非生物逆境和生物逆境的反應(yīng)中的重要作用，上述發(fā)現(xiàn)可能有助于黑麥和相關(guān)作物的有效遺傳研究和分子改良。
在長日照條件下，威寧黑麥比荊州黑麥提前抽穗10-12天（圖6a），這與威寧黑麥莖尖分生組織發(fā)育更快有關(guān)（圖6b）。在威寧黑麥基因組中，注釋到在長日照條件下高表達(dá)的兩個開花位點（FT）基因ScFT1（ScWN4R01G446100）和ScFT2（ScWN3R01G192500）。播種后7天和10天，ScFT1和ScFT2在威寧黑麥中的表達(dá)水平顯著高于荊州黑麥（圖6c），且ScFT蛋白在黑麥中積累到相對較高水平，而荊州黑麥中幾乎沒有（圖6d）。檢測到的ScFT蛋白的大小（~29 kDa）比預(yù)測出的ScFT1和ScFT2的分子量大（~19 kDa）（圖6d），表明ScFT蛋白具有潛在的翻譯后修飾。用高效檢測磷蛋白的磷酸標(biāo)記SDS-PAGE分析表明，威寧黑麥中ScFT確實發(fā)生了翻譯后磷酸化修飾。
作者突變了ScFT2磷酸化相關(guān)的兩個殘基（S76和T132），并為ScFT2構(gòu)建了一系列去磷模擬位點（S76A、T132A和S76A/T132A）和磷模擬位點（S76D、T132D和S76D/T132D）。當(dāng)使用馬鈴薯X病毒載體在煙草中進(jìn)行外源表達(dá)時，ScFT2和去磷雙突變體ScFT2S76A/T132A相對于游離GFP（對照）和其他ScFT2突變體，表現(xiàn)出持續(xù)促進(jìn)煙草生長（圖6e）。與GFP相比，ScFT2和三個去磷突變體（ScFT2S76A、ScFT2T132A及ScFT2S76A/T132A）的異位表達(dá)提高了開花植株的百分比，ScFT2S76A/T132A尤其明顯，但在表達(dá)三個擬磷突變體（ScFT2S76D, ScFT2T132D, or ScFT2S76D/T132D）中沒有觀察到這種促進(jìn)作用（圖6f）。免疫印跡分析表明，ScFT2、ScFT2S76A、ScFT2T132A和ScFT2S76A/T132A在煙草植株中的積累量相當(dāng)高，但ScFT2S76D、ScFT2T132D和ScFT2S76D/T132D在煙草植株中的積累量卻很低（圖6g）。因此，保守的S76和T132殘基的改變影響了ScFT2控制植物開花的功能，這與ScFT2蛋白穩(wěn)定性的改變有關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)FT磷酸化對開花時間控制的影響，為更全面地探索FT蛋白控制植物開花的分子和生化機(jī)制提供了新的途徑。
作者進(jìn)一步研究了光周期Photoperiod（Ppd）基因的表達(dá)，該基因在長日照條件下正調(diào)控FT的表達(dá)。在威寧和荊州黑麥的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)了一個表達(dá)Ppd的基因ScPpd1（ScWN2R01G043000）。該基因在威寧黑麥內(nèi)的表達(dá)非常早，在播種2 天后達(dá)到表達(dá)高峰；而荊州黑麥在播種4天后才達(dá)到高峰（圖6h）。根據(jù)ScPpd1對黑麥抽穗期的調(diào)控作用，研究者利用威寧×荊州F2代群體，檢測到與前期研究一致的三個主效抽穗期QTL（Hd2R、Hd5R和Hd6R）。
?圖6 威寧黑麥早期抽穗性狀的發(fā)育及基因表達(dá)特征
對馴化基因的分析可以促進(jìn)對作物性狀的理解和改良，但在黑麥中這類基因的分子分析方面進(jìn)展甚微。作者通過全基因組選擇清除分析，利用在栽培黑麥和瓦維洛夫黑麥（S. vavilovii）之間鑒定的123647個SNPs，挖掘黑麥馴化相關(guān)染色體區(qū)域和基因座。DRI、FST、XP-CLR分析中，共同識別到11個選擇信號（圖7a-c）。通過與水稻和大麥的共線性比較，發(fā)現(xiàn)了一些可能的選擇清除位點，包括已在水稻或大麥中已被功能分析的ScBC1、ScBtr、ScGW2、ScMOC1、ScID1和ScWx的同源基因（圖7a-c）。
檢測到的ScID1基因座包含一對具有相同編碼序列的ScID1同源序列（ScWN6R01G057200和ScWN6R01G057300，下稱ScID1.1和ScID1.2）（圖7d）。ScID1.1和ScID1.2蛋白與玉米ID1（63.19%）和水稻RID1（65.34%）具有很強的同源性，這兩個蛋白在玉米和水稻中都被發(fā)現(xiàn)調(diào)控著從營養(yǎng)體向花發(fā)育的轉(zhuǎn)換。ScID1.1和ScID1.2在威寧黑麥幼葉中的表達(dá)水平高于荊州黑麥（圖7e）。在威寧×荊州分離的F2群體中，ScID1JZ/JZ純合植株的平均抽穗期顯著晚于ScID1JZ/WN或ScID1WN/WN個體（圖7f），這與荊州黑麥相對于威寧黑麥的晚花表型相一致（圖6a）。以上結(jié)果表明ScID1可能參與了抽穗期的調(diào)控，并可能通過黑麥馴化進(jìn)行選擇，使作物成熟度得到適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以更好地適應(yīng)生長環(huán)境。
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