【成功案例】四川大學(xué)華西醫(yī)院利用ONT測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行新冠病毒全基因組測(cè)序

導(dǎo)讀

研究背景

1. 非靶向宏基因組序列:11個(gè)樣本使用Illumina NextSeq 500測(cè)序
2. 多重PCR +納米孔測(cè)序，制備MinION文庫(kù)
3. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、Sanger測(cè)序
4. Nsp1過(guò)表達(dá)和qRT-PCR、免疫共沉淀、ELISA、熒光素酶檢測(cè)、空斑試驗(yàn)

研究結(jié)果

與20家醫(yī)院和研究機(jī)構(gòu)合作，分析了在2020年1月22日至2月20日期間在中國(guó)四川省收集的流行病學(xué)、遺傳和臨床數(shù)據(jù)。2020年1-2月底，四川省經(jīng)qPCR檢測(cè)確診病例538例，其中成都病例占28.8%（圖1A）。四川確診病例呈指數(shù)增長(zhǎng)，2020年1月30日達(dá)到高峰，每天新增確診病例38例（圖1B）。若人員更密集，發(fā)生病例的頻率更高（圖1C），表明社交距離可能是防止病毒傳播的一個(gè)關(guān)鍵因素。

圖1 四川省SARS-CoV-2的時(shí)空流行病學(xué)研究

為了鑒定SARS-CoV-2病毒的遺傳變異，利用ARTIC生信分析流程鑒定單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入和缺失(indels)。在四川隊(duì)列的88個(gè)SARSCoV-2基因組中共發(fā)現(xiàn)104個(gè)snp和18個(gè)indel（圖1D）。大多數(shù)變異是單例，即只在一個(gè)基因組中觀察到。在鑒別出的變異中，31個(gè)SNPs和4個(gè)indels存在于2個(gè)以上的患者中（圖2A）。

對(duì)截至2020年11月9日存放在GISAID上的81391個(gè)高質(zhì)量公共基因組序列進(jìn)行分析，其中35個(gè)snp中有29個(gè)(82.8%)來(lái)自其他大洲;一些變異(C3037T、G26144T、C8782T、T28144C、G11083T和C18060T)在歐洲、非洲、大洋洲和美國(guó)流行，表明大多數(shù)snp已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行。與武漢人群的比較顯示，四川和武漢都存在另外四種變體，這些復(fù)發(fā)型包括三個(gè)Indels:Δ500-532, ACC18108AT和Δ729-737；一個(gè)SNP:T13243C（圖2A），表明這些變異可能是從武漢輸入的，與四川患者的旅行記錄一致。

圖2A 在不同大陸或地區(qū)研究的35個(gè)重復(fù)遺傳變異的樣本百分比

值得注意的是，在Nsp1編碼區(qū)有兩個(gè)缺失，Δ500-532和Δ729-737，在四川觀察到23例(26%)和2例(2.2%)；在武漢觀察到39例(24%)和4例(3%)。對(duì)Δ500-532的基因組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的不同簇中分布稀疏（圖2B）。結(jié)果表明Δ500-532發(fā)生在多個(gè)城市，并可能從武漢多次輸入，這與缺失Δ500-532的四川患者中有83.3%的人有去過(guò)武漢的旅行史相一致。

圖2B SARS-CoV-2基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

為了研究鑒定出的35個(gè)SARS-CoV-2復(fù)發(fā)遺傳變異(31個(gè)snp和4個(gè)indel)的潛在臨床意義，比較了出現(xiàn)嚴(yán)重或非嚴(yán)重癥狀的患者的臨床表型，將19個(gè)嚴(yán)重相關(guān)表型分為(11個(gè))嚴(yán)重表型和(8個(gè))非嚴(yán)重表型（圖3A）。

?圖3A 與COVID-19嚴(yán)重程度相關(guān)的顯著特征的火山圖

采用類似GSEA的分析方法，來(lái)鑒定一個(gè)突變體是否富集嚴(yán)重/非嚴(yán)重的臨床表型。發(fā)現(xiàn)Δ500-532與ESR等嚴(yán)重相關(guān)表型呈負(fù)相關(guān)。基于有/沒(méi)有某種變異類型，將病例分為兩組，發(fā)現(xiàn)感染Δ500 -532病毒的患者在所有檢測(cè)的35種變異中Ct值最高（圖3E）。

?圖3D Δ500 -532的性狀富集情況;

圖3E qPCR檢測(cè)中，有或沒(méi)有某一Ct值變體的組之間的NES和p值

計(jì)算了SARS-CoV-2基因組中每個(gè)堿基對(duì)的缺失頻率，Δ500-532位點(diǎn)是第五大最常見(jiàn)的缺失區(qū)域（圖4A）。測(cè)序結(jié)果支持高序列深度的缺失，并通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證了缺失（圖4B）。從GISAID的37個(gè)國(guó)家的922例病例中，在Δ500-532位點(diǎn)找到了24種缺失變異（圖4C）。其中62.5%和19.8%分別來(lái)自歐洲和北美（圖4D），主要變種為Δ518-520 (Δ1aa), Δ518-523 (Δ2aa)和Δ509-523(Δ5aa)（圖4E）。因此，研究結(jié)果顯示SARS-CoV-2基因組中存在一個(gè)缺失熱點(diǎn)，相關(guān)病例數(shù)量在全球范圍內(nèi)穩(wěn)步上升。

圖4 SARS-CoV-2基因組Δ500-532位點(diǎn)缺失變異的患病率

Δ500-532導(dǎo)致SARS-CoV-2 Nsp1 N端A₇₉PHGHVMVELV₈₉缺失11個(gè)氨基酸殘基，在預(yù)測(cè)的模型中，Δ500-532對(duì)應(yīng)區(qū)域的殘基形成一個(gè)中央β鏈，如果去除該β鏈，可能會(huì)導(dǎo)致桶狀折疊的完全破壞（圖5A）。

SARS-CoV-2 Nsp1的C端結(jié)構(gòu)域與40S核糖體亞基結(jié)合并干擾mRNA的進(jìn)入，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變的SARS-CoV-2 Nsp1保留了與40S核糖體亞基的結(jié)合能力（圖5B）。

?圖5 A Δ500-532基因座(橙色)在SARS-CoV-2 Nsp1 N端預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)上的映射；

圖5 B SARS-CoV-2 Nsp1突變蛋白結(jié)合40S核糖體亞基

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，與WT Nsp1相比，突變體Nsp1在生“肽的生物合成/代謝過(guò)程”，“核糖核蛋白復(fù)合生物發(fā)生”，“靶向膜/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)”，“mRNA代謝過(guò)程”和“無(wú)意義介導(dǎo)的衰變”等方面顯著上調(diào)，符合報(bào)道的SARS-CoV-2 Nsp1的功能（圖5D）。

值得注意的是，與GFP對(duì)照相比，WT中編碼核糖體蛋白(RPs)的mRNA代謝過(guò)程通路中的許多基因下調(diào)。相比之下，有兩個(gè)缺失組表現(xiàn)出不同于WT更類似于GFP對(duì)照的表達(dá)模式(圖5E)。這些結(jié)果表明，Nsp1中這些N端缺失可能影響其在mRNA和蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中的功能

圖5 C-E

由于Δ500-532在感染患者中與血清 IFN-β水平呈負(fù)相關(guān)，下一步評(píng)估缺失如何影響I型干擾素(IFN-I)應(yīng)答。轉(zhuǎn)染了HEK293T和A549(人肺細(xì)胞系)的細(xì)胞中，所有缺失變異均顯示IFN-I反應(yīng)降低。進(jìn)一步進(jìn)行了IFNB1啟動(dòng)子控制的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和對(duì)轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，系列接過(guò)說(shuō)明IFN-I信號(hào)在缺失突變體中被下調(diào)。

圖6G 與表達(dá)WT Nsp1的A549細(xì)胞相比，Δ500-532突變體中干擾素信號(hào)通路顯著下調(diào)（綠色表示下調(diào)，紅色表示上調(diào)）

為了研究Nsp1缺失對(duì)SARS-CoV-2病毒的影響，我們從臨床樣本中分離出WT、Δ518-520 (Δ1aa)和Δ509-517 (Δ3aa) Nsp1的毒株，實(shí)驗(yàn)感染Calu-3細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Nsp1缺失突變體具有復(fù)制能力，在Calu-3細(xì)胞中表現(xiàn)出與WT病毒相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，并誘導(dǎo)較低的IFN-I反應(yīng)。這些結(jié)果支持在關(guān)聯(lián)研究中觀察到的Δ500-532與血清IFN-b降低之間的關(guān)聯(lián)。