研究背景
?黃瓜（Cucumis sativus?L.）（2n=2x=14）是世界上重要的蔬菜作物，在馴化過程中經(jīng)歷了進(jìn)化瓶頸，因此其遺傳基礎(chǔ)尤其狹窄。陳勁楓教授團(tuán)隊(duì)將栽培黃瓜（Cucumis sativus?L., 2n=14）與野生酸黃瓜（C. hystrix?Chakr., 2n=24）進(jìn)行種間雜交，通過胚胎拯救和染色體加倍，甜瓜屬人工異源四倍體新物種“金瓜”并命名為Cucumis hytivus?Chen and Kirkbr.。金瓜具有明顯的生長力旺盛、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。
天然多倍體的親本基因組通常是未知的，或是在多倍體形成后已經(jīng)各自進(jìn)化，因而無法系統(tǒng)地區(qū)分由種間雜交和基因組加倍所引起的變化。因此，對(duì)具有明確遺傳背景的人工異源四倍體C.×hytivus的研究，可以解析多倍體化進(jìn)程中不同過程的潛在機(jī)制，從而揭示異源多倍體在自然界和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛存在的深層含義。
材料方法
- 材料：C.×hytivus自交第14代（S14）；測(cè)序：~69X PacBio+~104X Hi-C+Bionano；轉(zhuǎn)錄組輔助基因預(yù)測(cè):Illumina RNA-Seq 及 PacBio Iso-Seq
- 材料：F1、S0、S4-S13 （組裝用于比較基因組分析）測(cè)序：~80X Illumina X-TEN （scaffold N50=134~226 kb；contig N50 =47~73 kb）
研究內(nèi)容
- 異源四倍體C.×hytivus（S14）的組裝與注釋
- 亞基因組優(yōu)勢(shì)分析
- 種間雜交、基因組加倍和二倍體化
- 多倍體化拓寬物種遺傳基礎(chǔ)，增強(qiáng)物種適應(yīng)能力
主要研究結(jié)果
作者通過PacBio+BioNano+Hi-C+Illumina共組裝獲得530.8?Mb基因組（≈67%流式評(píng)估大??；≈77% survey評(píng)估大小；比對(duì)發(fā)現(xiàn)未裝出的為重復(fù)序列），contig N50=6.5?Mb，并將組裝的基因組序列掛載至19條假染色體上（掛載率97.23%；定序與定向率93.33%）（表1）。通過與二倍體C.sativus （CC）和C.hystrix（HH）染色體的C01–C07和H01–H12對(duì)應(yīng)，將C.×hytivus染色體命名為Chc01–Chc07和Chh01–Chh12（圖1）。
與已測(cè)序的栽培黃瓜基因組一樣，金瓜中大部分的TE為長末端重復(fù)序列。C.×hytivus（S14）的Chc亞基因組（SubC）含有的TEs少于二倍體C.sativus（CC）基因組，而Chh亞基因組（SubH）保持了幾乎相同的不同類型TEs的含量和比例。共預(yù)測(cè)了45687個(gè)基因，平均基因長3846bp，每個(gè)基因有5.26個(gè)外顯子。BUSCO評(píng)估結(jié)果為90.90%，CEGMA評(píng)估結(jié)果為97.82%。在CC和HH二倍體基因組中鑒定的18882個(gè)同源基因家族中，在C.×hytivus（S14）異源四倍體中也鑒定了18428個(gè)（97.60%）（圖2）。
表1 金瓜基因組組裝結(jié)果
??圖1 金瓜亞基因組間共線性（左）及亞基因組與二倍體祖先共線性（右）
??圖2 異源四倍體后基因的變化
作者將C.×hytivus（S14）基因組分為Chc（203.36 Mb）和Chh（287.37 Mb）兩個(gè)亞基因組，這兩個(gè)亞基因組均小于相應(yīng)的CC基因組（226.21 Mb）和HH基因組（297.49 Mb），分別包含的基因也比相應(yīng)的親本種少。與CC相比，在Chh亞基因組中檢測(cè)到的SVs更多，并且基因丟失更多。通過序列深度分析及同源交換（HE）分析表明，在C.×hytivus（S14）基因組中分別丟失11個(gè)CC和146個(gè)HH基因，同時(shí)更多的HH序列被CC序列替換。共線性基因?qū)υ?em>C.×hytivus（S14）亞基因組中的表達(dá)結(jié)果表明，CC顯性基因的數(shù)量明顯多于HH顯性基因（圖2C）。這些結(jié)果表明Chc亞基因組可能比Chh亞基因組更占優(yōu)勢(shì)。CC和Chc亞基因組的TE含量低于HH和Chh亞基因組，支持了由祖先細(xì)胞基因組中TE的差異密度驅(qū)動(dòng)異源多倍體中亞基因組偏向分化的假說（TEs的失活擴(kuò)散到附近的基因，TEs密度大的同源基因組的整體表達(dá)較弱，導(dǎo)致基因失活和最終丟失的可能性更大）。
異源多倍體化過程中的三個(gè)重要階段（種間雜交、基因組加倍和二倍體化）對(duì)異源多倍體基因組的作用各不相同。
為了區(qū)分其效果，作者分別在種間雜種F1、金瓜初世代S0和其他早期世代（S4~S13）中對(duì)S14世代中預(yù)測(cè)的157個(gè)確認(rèn)缺失的基因進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，F(xiàn)1中有102個(gè)基因缺失，表明種間雜交事件發(fā)生后，核基因組序列立即被消除。而F1中有個(gè)別缺失的基因在S0中再次出現(xiàn)，表明基因組加倍在異源多倍體中的作用與種間雜交截然不同。比較DNA序列分析顯示，相對(duì)于HH的葉綠體基因組，F(xiàn)1、S0和S4~S13的葉綠體基因組中共有195個(gè)SNPs和100個(gè)IndDels（圖4）。其中絕大多數(shù)SNPs（73.85%）和IndDels（73%）在F1中檢測(cè)到，推測(cè)多倍體中被廣泛發(fā)現(xiàn)的亞基因組優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象在種間雜交過程中就已經(jīng)基本確定了，并在后續(xù)的進(jìn)化過程逐漸累積。而在二倍體化過程中，基因組的變化也主要發(fā)生在最初的幾個(gè)世代（S0~S3），之后的世代中僅觀察到零星的核序列丟失（基因丟失），并且葉綠體基因組中沒有發(fā)現(xiàn)新的SNPs或InDels。
六代植物（S4、S6、S8、S10、S12和S14）的減數(shù)分裂染色體行為顯示，Chc亞基因組的單價(jià)體數(shù)量和滯后頻率顯著低于Chh亞基因組。表明該異源四倍體的Chh亞基因組存在一定的不穩(wěn)定性，從而表現(xiàn)出較高的序列丟失率。Chh基因的不穩(wěn)定性可能是導(dǎo)致C.×hytivus育性下降的主要原因?；ǚ劭扇拘噪S著世代的增加而穩(wěn)步增加，表明育性地逐步恢復(fù)（圖3a）。
圖３F1及早期世代花粉可染性研究（左）及缺失基因數(shù)（右）
?圖4 F1及早期世代葉綠體基因組SNPs（左）和InDels（右）分布
人工合成的多倍體新物種金瓜不僅表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)（生長力旺盛、營養(yǎng)價(jià)值高），同時(shí)還具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，并且C.×hytivus（S14）對(duì)根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）的抗性與HH相當(dāng)，且高于CC。于是作者對(duì)其進(jìn)行了基因序列與表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)金瓜中保留了來自雙親的大多數(shù)重復(fù)的NBS-LRR編碼基因（攜帶核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）和亮氨酸富集重復(fù)（LRR）結(jié)構(gòu)的NBS－LRR類抗性基因），使其具有更強(qiáng)的抗病能力，比親本物種具有更強(qiáng)的生存力。高溫和對(duì)照條件下，C.×hytivus與其兩個(gè)二倍體親本葉片的生長、生理反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平研究表明，主要參與光合生物的固碳、碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝相關(guān)的基因在C.×hytivus中顯著表達(dá)，而親本中則沒有。證實(shí)了在熱脅迫下，C.×hytivus葉綠素積累和光合作用的增強(qiáng)，進(jìn)一步說明了金瓜具有耐熱性。
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