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發(fā)布于 2021年2月18日

原文：NAD tagSeq for transcriptome-wide identification and characterization of NAD⁺-capped RNAs

發(fā)表雜志：Nature Protocols

影響因子：10.4

原文鏈接：https://sci-hub.ren/10.1038/s41596-020-0363-z

導讀

研究發(fā)現(xiàn)幾種NCIN（noncanonical initial nucleotides）可以給RNA“加帽”，并可能調(diào)節(jié)RNA的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄和翻譯。NAD^?+是最近發(fā)現(xiàn)的NCIN之一，能夠給很多物種“加帽”。鑒定NAD⁺capped RNA（NAD-RNA）可能有助于揭示cap介導的調(diào)控機制。本文報道了一種稱為NAD tagSeq的方法，用于NAD-RNA的全基因組分析。真核mRNA的5’末端一般都包含一個甲基化的帽子（m7G）,在轉(zhuǎn)錄起始形成。帽子不僅保護5’-3’核酸酶對mRNA的降解，而且可以形成一個cap-binding復合體，介導轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。最近研究發(fā)現(xiàn)RNA能被一系列非典型核苷酸衍生物加帽，比如NAD⁺，F(xiàn)AD，dpCoA，表明存在另一種帽子介導的基因調(diào)控。這些調(diào)控可能包括改變RNA的穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)錄起始以及與參與mRNA轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)相互作用。NAD^?+是細胞氧化還原反應中的核心輔酶，可能調(diào)節(jié)NAD-RNA的水平。但是，NAD-RNA的鑒定以及NAD ⁺cap介導的生物學功能在很大程度上是未知的。

1. NAD captureSeq

幾年前，開發(fā)了NAD captureSeq，用于NAD-RNA的轉(zhuǎn)錄組范圍分析。在NAD captureSeq中，腺苷二磷酸核糖基環(huán)化酶（ADPRC）用于將NAD ⁺的煙酰胺部分替換為含炔烴的分子，稱為4-戊炔-1-醇。然后通過點擊化學反應（銅催化的疊氮炔炔環(huán)加成（CuAAC））將炔基化產(chǎn)物與生物素疊氮化物連接。用鏈霉親和素樹脂富集生物素標記的RNA，然后制備通過二代測序技術（NGS）測序的cDNA文庫。陰性對照RNA樣品的處理方法相同，但不使用ADPRC。如果與陰性對照相比，在ADPRC處理的樣品中富集了特定的RNA，則其某些轉(zhuǎn)錄本被認為是NAD ⁺?capped。通過NAD captureSeq，已在細菌，酵母，植物和人類細胞中鑒定出NAD-RNA。缺點：非生物素化的RNA與鏈霉親和素樹脂的非特異性結合。由于NAD-RNA水平很低，因此非特異性結合可能會顯著降低敏感性并引入誤差。在生物素標記過程中RNA的斷裂以及隨后cDNA文庫的構建導致NAD-RNA總體序列結構信息的丟失。

2. CapZyme-Seq

CapZyme-Seq用于鑒定含有NAD⁺cap或其他非經(jīng)典caps的RNA。在這種方法中，RNA decapping酶（例如來自大腸桿菌的NudC）用于水解NCIN cap以形成5′-單磷酸RNA。然后將decapped的RNA與RNA寡核苷酸連接，而無法將m7G capped RNA與寡核苷酸連接。然后將與RNA寡核苷酸連接的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以通過高通量測序來擴增和鑒定NCIN-capped RNA。缺點：在CapZyme-Seq中，NudC不僅會水解NAD ⁺?cap，而且還會裂解其他非經(jīng)典caps，因此很難區(qū)分是否NAD-RNAs。

3. NAD tagSeq

與NAD captureSeq一樣，NAD tagSeq方法也使用ADPRC催化的反應和CuAAC反應來標記NAD-RNA。但是，NAD tagSeq不使用生物素標記NAD-RNA，而是在點擊化學反應中使用與合成RNA tag綴合的疊氮化物，從而使NAD-RNA與RNA tag連接（圖1）。然后，通過利用ONT平臺直接對RNA進行測序。RNA tag可作為NAD-RNA的標識符，這意味著假定在其5’端包含tag序列的RNA read被NAD⁺capped。RNA tag還可以用于通過與具有互補序列的DNA寡核苷酸雜交，來富集標記的RNA，富集步驟是可選的。通過富集，可以增加NAD-RNA的測序覆蓋率。如果不進行富集，則通過納米孔測序來識別標記和非標記轉(zhuǎn)錄物，從而獲得NAD-RNA與總轉(zhuǎn)錄組的比率。NAD tagSeq方法還可以對來自相同基因的NAD-RNA和總轉(zhuǎn)錄本的相對豐度進行定量。標記步驟之后，通過使用聚腺苷酸化酶將poly（A）尾巴添加到所有RNA中，因為只有含poly（A）的RNA可以通過牛津納米孔測序進行測序（圖1）。結果，NAD-RNA在5’端被RNA tag標記，在3’端被聚腺苷酸化，而其他RNA僅進行聚腺苷酸化。然后，對所有RNA與RTA連接，逆轉(zhuǎn)錄和連接RNA測序接頭。最后，通過Nanopore直接進行RNA測序。Guppy給出的reads后，需要鑒定NAD-RNA。堿基識別無法識別1,2,3-triazole附近的序列；因此，使用來自每個基因的tag和untagged的RNA分別代表NAD-RNA和noncapped RNA。由于tag RNA的長度為40個核苷酸，并且連接會影響堿基識別，因此對前40個核苷酸中具有12個連續(xù)tag RNA核苷酸的reads，將它們歸類為tag RNA。然后將reads與參考基因組和轉(zhuǎn)錄組比對，以找出只存在于ADPRC⁺樣品中的基因。標記的NAD-RNA的結構可通過Integrative Genomics Viewer可視化。

圖1 NAD tagSeq的流程

4. NAD tagSeq實驗設計

（1）使用model NAD-RNA驗證標記過程

為了分析RNA tag的標記效率，作者使用T7 RNA聚合酶通過體外轉(zhuǎn)錄合成了NAD-RNA模型（38個核苷酸）。NAD-RNA模型的轉(zhuǎn)錄是由T7 II類啟動子驅(qū)動，并且只有第一個轉(zhuǎn)錄的核苷酸是腺苷，因此NAD +可以在5’末端的轉(zhuǎn)錄本中摻入。然后合成NAD-RNA使用PAGE凝膠純化。使用PAGE凝膠進一步監(jiān)測model NAD-RNA的純度（圖2）。然后，model NAD-RNA與4-pentyn-1-ol進行ADPRC催化的化學酶反應，與tagRNA-疊氮化物（25個核苷酸）進行CuAAC反應。通過PAGE凝膠檢測產(chǎn)物，其中將缺乏ADPRC（ADPRC-）的反應用作陰性對照。

?圖2 純化的model NAD-RNA的凝膠電泳

（2）用于NAD tagSeq的RNA樣品制備

RNA的片段化和降解會降低使用NAD tagSeq識別NAD-RNA的效率。對于RNA樣品制備，建議使用新鮮的組織提取RNA?；蛘撸梢栽讷@得后立即在液氮中冷凍組織。建議在tag實驗中使用100μg?RNA。

（3）用RNA?tag標記NAD-RNA

為了進行反應，首先在ADPRC催化下，用接頭修飾model NAD-RNA或總細胞RNA。然后，與炔烴相連的RNA與特定的tagRNA-疊氮化物（40個核苷酸）進行點擊化學反應。陰性對照，除了不添加ADPRC以外，以相同方式處理樣品。陰性對照的結果有助于評估RNA分子非特異性標記產(chǎn)生的噪音。

（4）總RNA的聚腺苷酸化

納米孔直接RNA測序需要RNA包含poly（A）尾巴。如果將真核mRNA用作輸入樣品，則不需要聚腺苷酸化步驟。但是，如果研究的重點是其他類型的無聚腺苷酸尾巴的RNA，則需要進行聚腺苷酸化。該步驟由poly（A）聚合酶催化，向每個RNA添加poly（A）尾，然后使用oligo dT磁珠純化RNA。

（5）富集NAD-RNA用于深度測序

此步驟是可選的，可進行此操作以增加NAD-RNA的測序覆蓋度。標記的NAD-RNA被固定在磁珠上的DNA寡核苷酸富集，并具有與RNA tag互補的序列。

（6）文庫制備和利用MinION進行測序

通常，使用200–500 ng的RNA制備測序文庫。按照ONT公司的直接RNA測序方案，將RNA樣品與RTA連接，逆轉(zhuǎn)錄并與測序接頭連接，所有這些都可以通過納米孔直接RNA測序試劑盒完成。然后，可以在Nanopore測序設備上對生成的文庫進行測序。使用MinKNOW軟件和Guppy數(shù)據(jù)處理工具包進行堿基識別。

（7）從測序reads中鑒定NAD-RNA

盡管堿基識別軟件無法識別1,2,3-三唑鍵附近的序列，但Guppy給出的reads仍可通過tag RNA來確定NAD-RNA。在NAD tagSeq的原始應用程序中，作者開發(fā)了Python腳本，并結合了諸如Guppy和Minimap2（ref.）之類的可用工具來實現(xiàn)數(shù)據(jù)分析。為了提高該方法的性能，建立了稱為TagSeqTools的計算流程。在這里，介紹了一組用于識別和定量NAD-RNA的詳細過程，該過程使用TagSeqTools和現(xiàn)有軟件（例如FastQC）。使用TagSeqTools中的TagSeek模塊區(qū)分NAD-RNA和非NAD RNA。

從TagSeek步驟生成的帶標簽和不帶標簽的reads可以接受TagSeqQuant，它使用Minimap2的默認比對參數(shù)。在TagSeqQuant中，還通過FastQC對reads進行質(zhì)量檢查，并生成一個html文件以顯示測序質(zhì)量。經(jīng)過上述分析步驟后，將生成NAD-RNA和非NAD-RNA的基因覆蓋文件，以進行IGV可視化（圖3），并生成基因和isoforms的計數(shù)表以進行進一步分析。

圖3 NAD-RNA和noncapped-RNA reads可視化圖

5. NAD tagSeq的優(yōu)缺點

優(yōu)勢：首先，NAD tagSeq可以使用5’端的RNA tag作為有效的工具，以過濾掉一些假陽性。在NAD captureSeq中，將非特異性結合鏈霉親和素樹脂的RNA分子與生物素標記的RNA一起轉(zhuǎn)換為cDNA文庫。非特異性結合問題也發(fā)生在NAD tagSeq中。但是，NAD tagSeq可以使用直接RNA測序通過RNA tag的存在來區(qū)分NAD-RNA與其他非特異性結合的NAD-RNA。其次，NAD tagSeq不需要像NAD captureSeq一樣的PCR程序，通過避免PCR引起的偏倚，可以使NAD-RNA的定量更加準確。NAD tagSeq還允許定量總轉(zhuǎn)錄本中NAD-RNA的絕對豐度和相對豐度。第三，NAD tagSeq比NAD captureSeq更簡單，因為可以在標記后直接識別RNA，因此省去了制作cDNA文庫的整個過程。

第四，NAD tagSeq可以揭示NAD-RNA的整體序列。ONT測序技術允許將RNA分子從3’端到5’端測序。因此，可以揭示RNA分子的序列。它允許分析cap如何通過轉(zhuǎn)錄后修飾（如選擇性剪接或5’非翻譯區(qū)）調(diào)節(jié)RNA功能。

第五，將來可能會應用通過合成RNA tag標記NAD-RNA然后進行直接RNA測序的想法，以開發(fā)類似的方法來鑒定其他NICN-capped RNA，可以開發(fā)特定的酶和/或點擊化學反應來標記其他NCIN capped RNA。

局限性：納米孔測序從3’端到5’端，有時會導致reads被截斷，這意味著RNA的5’區(qū)域可能未測序。因此，某些沒有RNA tag的reads可能來自NAD-RNA，這會引入一些假陰性。

此外，如果在標記之前不進行聚腺苷酸化步驟，RNA的斷裂（例如在銅離子存在下的點擊化學反應期間）可能會導致假陰性。

NAD?tagSeq的另一個缺點是，由于ONT芯片的成本很高，它比NAD?captureSeq更為昂貴。此外，Oxford Nanopore測序平臺在對小RNA進行測序方面存在局限性。獲得的短測序reads（不包括poly（A）尾部和RNA標簽序列）約為80個核苷酸，這增加了一些小NAD-RNA可能被該分析遺漏的可能性。推測Illumina測序也可用于NAD tagSeq。但是，還需要進一步測試逆轉(zhuǎn)錄酶是否可以通過RNA tag和NAD cap之間的joint以到達RNA tag區(qū)域。

總結

NAD tagSeq結合ONT direct RNA檢測方案可用于全基因組范圍內(nèi)的鑒定和定量，包括真核生物和原核生物在內(nèi)的不同生物體中的NAD RNA。它可用于比較不同樣品中的NAD-RNA圖譜，并分析細胞NAD-RNA的總體水平和單個NAD-RNA的水平。如果跳過tag RNA的富集，則該方法可產(chǎn)生同一基因中NAD-RNA的豐度和總轉(zhuǎn)錄本的信息。此外，NAD-RNA的整個序列結構可以通過長讀測序技術揭示出來。該技術可用于分析不同生理條件下的NAD-RNA，并將其與總轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進行比較，以揭示NAD RNA在介導基因表達中的可能作用。