【項(xiàng)目案例】群體研究——BSA、遺傳圖譜應(yīng)用案例

利用基因組重測(cè)序技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模高通量SNP標(biāo)記鑒定是當(dāng)前國(guó)際上動(dòng)植物基因組學(xué)的研究熱點(diǎn)。利用得到的大量SNP標(biāo)記，可以對(duì)群體進(jìn)行高密度遺傳圖譜、BSA、GWAS、遺傳進(jìn)化等分析。百邁客在群體研究領(lǐng)域又有哪些應(yīng)用呢？下面和小編一起學(xué)習(xí)一下遺傳圖譜和BSA的項(xiàng)目案例。

遺傳圖譜

遺傳圖譜（Genetic map），是基于全基因組重測(cè)序技術(shù)或簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)某物種家系樣本進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法，開(kāi)發(fā)SNP分子標(biāo)記，計(jì)算標(biāo)記間的遺傳連鎖距離，繪制高密度遺傳圖譜。利用遺傳圖譜，主要可以進(jìn)行QTL定位，比較基因組，輔助基因組組裝等科研工作。本研究報(bào)道了利用百邁客SLAF測(cè)序技術(shù)，對(duì)菊花F1群體測(cè)序并構(gòu)建高密度遺傳圖譜，用于菊花花型等性狀的QTL定位及候選基因鑒定的研究。

菊花 (Chrysanthemum×morifolium Ramat.) 作為重要的觀賞性植物，花型對(duì)于它至關(guān)重要。舌狀花花冠筒基部合生程度（CTMD）和舌狀花相對(duì)數(shù)量（RNRF）是影響花型的兩個(gè)關(guān)鍵性狀，但由于這兩個(gè)性狀構(gòu)成要素相對(duì)復(fù)雜，其遺傳機(jī)制還未被揭示，進(jìn)而限制了菊花花型改良的定向育種。
本研究對(duì)CTMD和RNRF差異較大的菊花‘Candy’和菊花‘225’親本以及305個(gè)F1代雜交群體進(jìn)行了SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，測(cè)序深度分別為57.48X，59.69X和23.52X，通過(guò)分析鑒定得到了234,648個(gè)高質(zhì)量SNPs，利用高質(zhì)量的SNPs構(gòu)建了一套總圖距為4301.5cM、平均圖距為0.76cM的菊花高密度遺傳圖譜，為菊花花型遺傳育種研究提供了豐富的遺傳標(biāo)記。

圖1 雙親的花型表現(xiàn)

圖2 菊花高密度遺傳圖譜

基于這一圖譜，結(jié)合連續(xù)兩年的表型數(shù)據(jù)，對(duì)9個(gè)菊花花型性狀進(jìn)行了QTL分析，定位到123個(gè)相關(guān)QTLs位點(diǎn)；控制CTMD的QTLs有16個(gè)（圖3），其中有3個(gè)為主效QTLs，LOD值分別為3.77，5.09和5.23（圖4）；控制RNRF的QTLs有34個(gè)（圖5），其中有4個(gè)為主效QTLs。LOD值分別為4.11，4.74，4.96和5.22（圖6）。

圖3 CTMD性狀的QTL定位結(jié)果

圖4 CTMD性狀的主效QTL定位結(jié)果

圖5 RNRF性狀的QTL定位結(jié)果

圖6 RNRF性狀的主效QTL定位結(jié)果

為了進(jìn)一步發(fā)掘潛在的候選基因，將菊花遺傳圖譜與已發(fā)表的近緣物種向日葵和生菜的基因組進(jìn)行共線性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菊花遺傳圖譜上有150個(gè)SNPs標(biāo)記可以比對(duì)到向日葵基因組，0.12%的SNPs標(biāo)記可以比對(duì)到生菜基因組；依據(jù)基因組注釋信息，檢測(cè)得到向日葵基因組中有8個(gè)候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)，生菜基因組中有20個(gè)候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)。利用同樣的方法，對(duì)甘野菊（C. seticuspe）的參考基因組和兩個(gè)野生菊花，毛華菊（C. vestitum）和甘菊（C. lavandulifolium） 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)做了分析，得到了一些與CTMD和RNRF性狀相關(guān)的候選基因。
本研究通過(guò)構(gòu)建菊花高密度遺傳圖譜，為菊花高密度遺傳定位和與花型性狀相關(guān)的QTL鑒定提供了有用的基準(zhǔn)信息，為進(jìn)一步闡明菊花花型遺傳機(jī)理提供了新見(jiàn)解，同時(shí)也有利于加速菊花花型的定向改良育種。

Bulked Segregant Analysis (BSA)

BSA（Bulk Segregant Analysis）分析是利用極端性狀個(gè)體混池快速進(jìn)行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應(yīng)用在植物基因克隆方面。利用該方法，可以快速的對(duì)單一性狀進(jìn)行精細(xì)定位，加速目標(biāo)性狀的功能基因組研究進(jìn)程。本研究利用百邁客SLAF-BSA-seq技術(shù)，結(jié)合親本重測(cè)序，對(duì)番茄柱頭外露基因進(jìn)行基因定位，并對(duì)定位基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

番茄（Solanum lycopersicum）作為自花授粉作物，有著超然的雜種優(yōu)勢(shì)，其雜交品種產(chǎn)量高，抗性好，因此番茄在生產(chǎn)上多采用雜交種。目前，在研究番茄雜交育種過(guò)程中，利用雄性不育系協(xié)助雜交種子的生產(chǎn)成為了新趨勢(shì)。本研究主要從形態(tài)、生理及基因定位三個(gè)方面進(jìn)行研究。
本研究利用石蠟切片法對(duì)其結(jié)構(gòu)變化及不育原因進(jìn)行觀察，觀察不育材料T431（圖1E）與對(duì)照材料（圖1B）成熟花柱的橫切，可以看出不育材料T431花柱中的維管束數(shù)目多于對(duì)照材料。同時(shí)形態(tài)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)不育材料花柱直徑顯著大于對(duì)照材料，維管束數(shù)目的增多可能直接導(dǎo)致了不育材料花柱直徑變大（圖1C, D, F, G）。觀察成熟花柱的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)不育材料與對(duì)照材料花柱細(xì)胞大小沒(méi)有顯著差別。因此說(shuō)明不育材料花柱伸長(zhǎng)是由花柱細(xì)胞數(shù)目增多導(dǎo)致而非細(xì)胞體積變大導(dǎo)致。

圖1 花柱解剖結(jié)構(gòu)圖

采用高效液相色譜法對(duì)花柱中不同時(shí)期的五種激素含量的變化進(jìn)行了分析，從整體含量變化來(lái)看，不育材料T431中IAA的增長(zhǎng)率達(dá)到了176.6%，而對(duì)照材料中IAA的增長(zhǎng)率僅為25.6%，說(shuō)明不育品種中花柱維管束數(shù)目增多可能是由于IAA水平的升高導(dǎo)致（圖2 A）；GA3含量整體變化趨勢(shì)一致，GA3含量在不育材料T431中均高于對(duì)照材料（圖2B）；在花發(fā)育前期可育材料中ZT含量高于不育材料T431，后期出現(xiàn)波動(dòng)（圖2C）；ABA含量在對(duì)照材料中從整體上來(lái)看呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)，而不育材料T431中則較為平穩(wěn)，并沒(méi)有明顯的變化（圖2D）；不育材料T431中SA含量在花不同發(fā)育時(shí)期的變化趨勢(shì)與對(duì)照材料呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（圖2E）。結(jié)果表明不育材料T431中GA3水平的提升，IAA和ZT含量的積累，ABA與水楊酸的不同變化趨勢(shì)以及這5種激素間的相互作用均對(duì)花柱的伸長(zhǎng)產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致不育的發(fā)生。

圖2 T431（不育材料）和DL5（對(duì)照材料）中不同激素在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)
1-4分別表不花蕾長(zhǎng)度0.5 cm．0.7 cm，0.9 cm，1.1 cm；5-8分別表示花瓣開(kāi)張角30°，45°，60°，90°。

作者利用親本重測(cè)序技術(shù)與Super-SLAF-BSA-seq的方法相結(jié)合來(lái)對(duì)番茄部位不育基因進(jìn)行定位。以番茄位置不育型雄性不育材料T431為父本，可育材料DL5為母本進(jìn)行雜交，得到F1代，再將F1代自交獲得F2代分離群體，在F2代中選取50株不育株和50株可育株，構(gòu)建可育池和不可育池，提取父本和母本的DNA，構(gòu)建父本池和母本池，最終得到4個(gè)混池；分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)子代混池樣本間共有154,756個(gè)SLAF標(biāo)簽，使用BWA軟件將SLAF標(biāo)簽定位到番茄基因組上，對(duì)不同染色體上的SLAF標(biāo)簽和多態(tài)性SLAF標(biāo)簽的數(shù)目進(jìn)行匯總（圖3）,通過(guò)SNP的檢測(cè)和過(guò)濾，最終得到9,411個(gè)高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)。

圖3 SLAF標(biāo)簽分布圖（A）和多態(tài)性SLAF標(biāo)簽分布圖（B）

接著利用混池間差異SNP的深度差異，使用ED算法來(lái)分析計(jì)算與目的基因相連鎖的區(qū)域，結(jié)果顯示12號(hào)染色體上存在兩個(gè)較大且較明顯的區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域的大小分別為1.75 Mbp和3.15 Mbp，作者最終確定這兩個(gè)區(qū)域與目標(biāo)基因相連鎖，并將其選為候選區(qū)域（圖4）；利用百邁客云平臺(tái)分析，在番茄12號(hào)染色體上的兩個(gè)候選區(qū)域內(nèi)共找到26個(gè)候選基因，通過(guò)GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，最終將Solyc12g027610.1確定為本研究的候選基因；對(duì)該基因功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Solyc12g027610.1參與了細(xì)胞分裂素的代謝過(guò)程，且與多種激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。另外，Solyc12g027610.1作為一個(gè)乙烯受體蛋白，與番茄乙烯受體基因SlETR以及擬南芥中編碼蛋白AtEIN4的乙烯基因高度同源。

圖4 兩個(gè)混池的BSA分析結(jié)果

最后，作者對(duì)番茄SILst基因進(jìn)行基因功能驗(yàn)證及亞細(xì)胞定位；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，基因SlLst于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中均有分布；通過(guò)對(duì)基因SlLst過(guò)表達(dá)番茄的表型分析進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，表明基因SlLst在柱頭外露過(guò)程中起重要作用。
本研究分析了番茄外露柱頭的形態(tài)變化和激素作用，結(jié)合親本重測(cè)序和SLAF-BSA-seq，快速定位到番茄外露柱頭候選基因SlLst，并對(duì)基因SlLst進(jìn)行了功能分析，為基因克隆及分子標(biāo)記輔助育種提供一條強(qiáng)有力的途徑。

好消息

目前百邁客云平臺(tái)已經(jīng)把全基因組重測(cè)序分析、BSA分析、GWAS、遺傳進(jìn)化分析四種測(cè)序分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了云交付。百邁客云分析平臺(tái)整合了目前最主流的分析流程，結(jié)果準(zhǔn)確有保證，分析過(guò)程簡(jiǎn)單易上手，從數(shù)據(jù)上傳到參數(shù)設(shè)置，再到基因組選擇，只需簡(jiǎn)單幾步就可以完成項(xiàng)目數(shù)據(jù)的投遞和分析；結(jié)題報(bào)告云交付，分析完成即可拿到項(xiàng)目結(jié)果。詳情咨詢當(dāng)?shù)劁N售！

參考文獻(xiàn)

[1] Song XB, Xu YH, Gao K, et al. High-density genetic map construction and identification of loci controlling flower-type traits in Chrysanthemum (Chrysanthemum × morifoliumRamat.). Hortic Res, 2020.07

[2] Cheng MZ, Gong C, Zhang B, et al. Morphological and anatomical characteristics of exserted stigma sterility and the location and function of SlLst (Solanum lycopersicum Long styles) gene in tomato. Theor Appl Genet. 2020.11