一個(gè)物種不僅需要高質(zhì)量的基因組序列信息,同時(shí)還需要高準(zhǔn)確的基因注釋信息，這是后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，因而進(jìn)行高質(zhì)量的基因注釋顯得尤為重要。
一、真核生物基因結(jié)構(gòu)及注釋方式
真核生物基因在結(jié)構(gòu)分為外顯子和內(nèi)含子，在轉(zhuǎn)錄過程中會(huì)修剪內(nèi)含子，并拼合外顯子最后形成轉(zhuǎn)錄本。正是由于這種剪切形式的存在，造成了真核生物基因可以采用不同的剪接形式（可變剪接），形成不同的轉(zhuǎn)錄本，從而發(fā)揮更加廣泛且精準(zhǔn)的作用，這也導(dǎo)致了真核生物基因結(jié)構(gòu)注釋難度較大。另外基因組中大量非編碼區(qū)域的存在也嚴(yán)重影響基因的定位，造成精準(zhǔn)注釋的困難！
圖1 真核生物基因結(jié)構(gòu)[1]
（1）同源預(yù)測(homology-based prediction)：目前已發(fā)表大量基因組，可以利用物種間基因序列較好的保守性，使用已有的高質(zhì)量近緣物種注釋信息通過序列聯(lián)配的方式確定外顯子邊界和剪切位點(diǎn)。目前常用的軟件有GeneWise、GeMoMa等，GeMoMa預(yù)測效果較好。
（2）從頭預(yù)測(de novo prediction)：通過已有的基因特征訓(xùn)練模型來預(yù)測基因結(jié)構(gòu)，一般預(yù)測基因數(shù)量較多，準(zhǔn)確性較低，但在有好的訓(xùn)練集條件下，如有全長轉(zhuǎn)錄本提供訓(xùn)練集和預(yù)測證據(jù)，也能取得很好的效果。常用的軟件有AUGUSTUS、GlimmerHMM、SNAP、GeneID、GenCsan等。
（3）基于轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(transcriptome-based prediction)：指通過物種各個(gè)組織混合的RNA-seq和三代全長轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)來輔助預(yù)測。由于轉(zhuǎn)錄組這種數(shù)據(jù)是轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的直接反應(yīng)，因而利用此種類型數(shù)據(jù)，可以比較真實(shí)準(zhǔn)確的確定外顯子區(qū)域和剪切位點(diǎn)，在基因預(yù)測三種策略中屬于可靠性最高的策略。常用的軟件有PASA、TransDecoder、GeneMarkS-T等。
總之三種方法各有優(yōu)劣，如同源預(yù)測受限于近緣物種注釋質(zhì)量，但在近緣物種注釋質(zhì)量較高的前提下可以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)基因的準(zhǔn)確注釋；從頭預(yù)測，預(yù)測基因數(shù)量多，但完整度好，不容易丟失一些基因，尤其是在近緣物種中沒有的新基因，但其不可避免引入一些假的預(yù)測結(jié)果；轉(zhuǎn)錄組預(yù)測，準(zhǔn)確度最高，但由于表達(dá)的基因一般也就只有60%~70%左右，所以檢測到的基因數(shù)量有限。故最后一般要用EvidenceModeler(EVM)等工具進(jìn)行三種預(yù)測策略的整合，再進(jìn)行后續(xù)的蛋白功能域、代謝通路等的注釋。
圖2 從頭預(yù)測、基于轉(zhuǎn)錄組預(yù)測及同源預(yù)測基因結(jié)構(gòu)展示[2]
二、二代轉(zhuǎn)錄組和三代全長轉(zhuǎn)錄組在基因預(yù)測中對(duì)比
二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通常打斷成小片段進(jìn)行測序，后期通過對(duì)小片段組裝（如采用Tirnity軟件)，獲取相對(duì)完整的轉(zhuǎn)錄本。但是由于測序片段較短可能會(huì)存在組裝錯(cuò)誤或者組裝不完整，導(dǎo)致不能準(zhǔn)確獲得完整轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而對(duì)基因預(yù)測的完整性和準(zhǔn)確性產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。
01 獲得準(zhǔn)確的完整轉(zhuǎn)錄本
基于三代測序平臺(tái)可以直接獲取轉(zhuǎn)錄本的5ˊ到3ˊ高質(zhì)量全長序列，無需組裝，一條read即可跨越全長轉(zhuǎn)錄本，因此通過將read比對(duì)基因組就能夠非常容易的確定基因在基因組上的位置和其完整結(jié)構(gòu)，因而非常有利于基因的注釋工作，且準(zhǔn)確性較高（參見下圖以水稻一個(gè)基因?yàn)槔?/p>
?圖3?三種數(shù)據(jù)比對(duì)基因組結(jié)果
圖3中最下方為參考轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，可見三代平臺(tái)均實(shí)現(xiàn)一條read覆蓋，且存在多條read同時(shí)支持，二代平臺(tái)則由眾多短read組成，后續(xù)組裝需借助算法才能組裝到完整轉(zhuǎn)錄本，存在不確定性。
02獲得準(zhǔn)確的可變剪接
在可變剪接方面，三代全長測序結(jié)果可以捕獲更多、更準(zhǔn)的、不同可變剪切形成的轉(zhuǎn)錄本，如圖4顯示，Exon2和Exon6以及Exon9是三個(gè)轉(zhuǎn)錄本間共享，二代多數(shù)短read單條連一個(gè)外顯子區(qū)都無法跨越，對(duì)于完全比對(duì)到這3個(gè)外顯子區(qū)的短reads無法區(qū)分其來源轉(zhuǎn)錄本。而Nanopore長讀長測序可以直接得到3種全長轉(zhuǎn)錄本，因此對(duì)于轉(zhuǎn)錄本可變剪接識(shí)別更準(zhǔn)確。
圖4 ?二代轉(zhuǎn)錄組與ONT全長轉(zhuǎn)錄組識(shí)別可變剪接
三、Nanopore在三代全長轉(zhuǎn)錄組輔助基因預(yù)測中的優(yōu)勢
01數(shù)據(jù)及成本更親和
長度長在轉(zhuǎn)錄本分析方面比短讀長測序技術(shù)有明顯的優(yōu)勢。PacBio平臺(tái)由于測序原理限制，一個(gè)ZMW孔只能循環(huán)測序一個(gè)分子，加上芯片中 ZMW 孔數(shù)限制，需要較大的數(shù)據(jù)量以及更多的測序芯片才能達(dá)到飽和，成本相對(duì)較高。Nanopore測序原理使得在一個(gè)分子穿越納米孔后其他分子還可繼續(xù)穿行，更少的數(shù)據(jù)量可以獲得更多的信息，因此成本也更加親和。百邁客研發(fā)團(tuán)隊(duì)將相同物種不同平臺(tái)的結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)預(yù)測到數(shù)量近似相等的高準(zhǔn)確的基因時(shí)，PacBio平臺(tái)所需轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于Nanopore（表1）。
表1 不同物種PacBio與Nanopore獲取相近高準(zhǔn)確基因數(shù)量時(shí)對(duì)應(yīng)所需數(shù)據(jù)量
注：基因數(shù)：identity和coverage均大于90時(shí)的高準(zhǔn)確基因數(shù)
02準(zhǔn)確性具有保障
三代測序的錯(cuò)誤率太高，會(huì)不會(huì)對(duì)結(jié)果有影響呢？目前Nanopore下機(jī)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率已經(jīng)可以到90%，即堿基平均錯(cuò)誤率為10^(-1)=10%左右，完全可以將read準(zhǔn)確的回帖到參考基因組中的，因此不會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤比對(duì)的情況。唯一需要解決的是可變剪接位點(diǎn)比對(duì)位置的準(zhǔn)確性，目前我們基于自己開發(fā)的軟件NanoGAP，借助于二代RNA-seq數(shù)據(jù)、自身ONT數(shù)據(jù)及其他方法預(yù)測結(jié)果，共同糾正轉(zhuǎn)錄本剪接位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了在小數(shù)據(jù)量情況下與PB CCS模式下同等的準(zhǔn)確性（見表1及圖5）！
圖5?NanoGAP預(yù)測結(jié)果示意圖
圖5中分別展示了RNA-seq和ONT原始數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果，參考基因的結(jié)構(gòu)和經(jīng)過NanoGAP糾正和聚類后此位置轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。其中NanoGAP預(yù)測到的ONT final Alt1轉(zhuǎn)錄本，其結(jié)構(gòu)與參考基因結(jié)構(gòu)完全一樣，證明我們采ONT數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測的高準(zhǔn)確性。同時(shí)NanoGAP預(yù)測到的一個(gè)新的可變剪接ONT final Alt2，表明擁有更長讀長的ONT在獲取可變剪接方面存在一定優(yōu)勢。
03物種與數(shù)據(jù)量需求
進(jìn)行基因的預(yù)測，不同于有參條件下進(jìn)行基因的表達(dá)定量。由于三代測序存在一定的錯(cuò)誤率，所以我們需要通過增加數(shù)據(jù)量實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄本的糾正，進(jìn)而獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本，用于基因的輔助預(yù)測。那么多少數(shù)據(jù)量適合呢？不同的物種的需求是否不同呢？百邁客研發(fā)團(tuán)隊(duì)抱著這樣的疑問進(jìn)行了多輪多物種Nanopore數(shù)據(jù)檢測，研究結(jié)果顯示不同物種具有數(shù)據(jù)量需求差異，在5-20 Gb時(shí)隨著數(shù)據(jù)量的增加，預(yù)測到的高準(zhǔn)確基因數(shù)迅速上升，部分物種在10G左右預(yù)測到的高準(zhǔn)確基因數(shù)量可以達(dá)到最大，在數(shù)據(jù)到20 Gb左右時(shí)，絕大多數(shù)物種已達(dá)到高準(zhǔn)確基因覆蓋度飽和。而多倍體物種在20-30 Gb時(shí)，高準(zhǔn)確基因覆蓋度基本達(dá)到最大。
04具有拓展應(yīng)用
組織差異越大，基因的表達(dá)差異通常也越大，因此基于轉(zhuǎn)錄組預(yù)測的方式需要多組織進(jìn)行混樣分析以獲得更全面的基因信息。與PB相比ONT還具有無GC含量和堿基偏好性、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量準(zhǔn)確的特性，在混合數(shù)據(jù)應(yīng)用于注釋分析前，可以用作多組織/多處理下的表達(dá)差異分析。實(shí)現(xiàn)樣本一次檢測多種分析，完成數(shù)據(jù)最大利用率，也為文章添光增彩。
四、案例分析
研究者分別用二代與三代全長轉(zhuǎn)錄測序?qū)﹀a蘭鉤口線蟲（Ancylostoma ceylanicum）基因結(jié)構(gòu)預(yù)測，研究發(fā)現(xiàn)三代全長測序與二代測序相比的一個(gè)顯著特點(diǎn)是UTR的數(shù)量和長度增加，尤其是3’UTR，帶有3’UTR和5’UTR的基因數(shù)量分別增加了5倍和3倍。研究結(jié)果說明了長讀長在定義基因UTR和因此更完整的ORF方面的優(yōu)勢。而研究表明UTR區(qū)域與真核生物中基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性相關(guān)，進(jìn)一步說明了全長測序在基因發(fā)現(xiàn)和識(shí)別基因邊界方面的重要性[3]。
圖6 （A）3’UTR和（B）5’UTR的全長和RNA-seq之間UTR長度的差異
進(jìn)一步的基因鑒定結(jié)果顯示，基于二代轉(zhuǎn)錄本的BLASTX（紅色）和protein2genome（藍(lán)色）預(yù)測了一個(gè)短基因模型，但是全長轉(zhuǎn)錄序列（綠色）擴(kuò)展了現(xiàn)有的基因，并預(yù)測了一個(gè)新的基因[3]。除此之外，研究者通過三代全長技術(shù)共鑒定1609個(gè)（9.2%）新基因，表明了全長轉(zhuǎn)錄組的加入使基因注釋更豐富。
圖7 二代與三代基因結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果比較
五、尾聲
綜上所述，我們不難發(fā)現(xiàn)：全長轉(zhuǎn)錄組輔助基因預(yù)測與二代技術(shù)相比具有
①三代技術(shù)直接得到全長轉(zhuǎn)錄本，無需組裝，結(jié)果更可靠，基因定位和結(jié)構(gòu)注釋更加準(zhǔn)確；
②轉(zhuǎn)錄本可變剪接識(shí)別更加容易，結(jié)果也更加可靠
③轉(zhuǎn)錄本的5’和3’端覆蓋更均勻、完整，基因的UTR(非翻譯區(qū))定位更加精準(zhǔn)等優(yōu)勢；
而三代測序中，Nanopore與PacBio相比，又具有低數(shù)據(jù)量飽和的優(yōu)勢（大多數(shù)物種20 Gb基本可以達(dá)到飽和及分析需求），低成本高收益的方式為科研之路提供了新的方向。
（1）全長轉(zhuǎn)錄組提升玉米基因組注釋(Li C?et al., Nature Communications.2020)：
（2）ONT輔助金線鯔魚轉(zhuǎn)錄組注釋統(tǒng)計(jì)（Kadobianskyi M et al., Scientific Data.2019):
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