前沿 | 轉(zhuǎn)錄組測序揭示可變剪接異常導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性

研究背景

色素性視網(wǎng)膜炎（RP)是常見的遺傳性視網(wǎng)膜失明之一，大約2500個新生兒中有1個患有視網(wǎng)膜失明，在世界范圍內(nèi)超過100萬人受到影響。到目前為止，RP還沒有有效的治療方法，仍然是一種具有醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)性的疾病。大約15%的RP是由pre-mRNA加工因子（PRPF）PRPF8、PRPF31、PRPF3、PRPF4、PRPF6和SNRNP200的突變引起的常染色體顯性形式。

pre-mRNA的可變剪接通過包含不同的外顯子或在mRNA中保留內(nèi)含子，擴(kuò)大了真核基因組的編碼能力，使相對較少的基因能夠編碼不同的蛋白質(zhì)組。高水平的剪接多樣性發(fā)生在脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)。例如，鼠視桿和視椎光感受器有一個特定的剪接程序，這種特殊的剪接程序主要影響編碼光感受器初級纖毛和外段組成成分（光轉(zhuǎn)導(dǎo)必需成分）的轉(zhuǎn)錄本。而視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）的成熟也需要功能性原發(fā)性纖毛。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，對光感受器特異性轉(zhuǎn)錄本的剪接程序的√確調(diào)控對視網(wǎng)膜發(fā)育至關(guān)重要，包括那些參與纖毛發(fā)生的轉(zhuǎn)錄本。

PRPF的突變影響剪接體組裝的化學(xué)計(jì)量學(xué)和動力學(xué)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能所需基因的轉(zhuǎn)錄失調(diào)或PRPF突變蛋白的錯誤折疊和聚集，從而觸發(fā)光感受器中的凋亡。然而，與PRPF相關(guān)的RP疾病機(jī)制尚不清楚，也不確定RPE或光感受器是否是主要受影響的組織。矛盾的是，雖然PRPF廣泛表達(dá)，但是其突變只會導(dǎo)致視網(wǎng)膜特異性退化，這就提出了一個問題，為什么視網(wǎng)膜細(xì)胞更容易受到這些剪接因子缺陷的影響。此外，PRPF動物模型作為研究對象時，要么不能再現(xiàn)人類RP表型，要么僅表現(xiàn)出晚發(fā)性RPE缺陷。

研究結(jié)果

由于人來源的多能干細(xì)胞（iPSC）可以分化為RPE和光感受器，作者開發(fā)了患者來源的視網(wǎng)膜細(xì)胞作為獨(dú)特的生理相關(guān)疾病模型，以期對剪接因子RP的分子發(fā)病機(jī)制有新的認(rèn)識。作者從4名RP11患者iPSC中獲得了RPE和3D視網(wǎng)膜類器官，這些患者的臨床嚴(yán)重程度因兩種PRPF31缺失突變而不同。大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了受PRPF31突變影響的細(xì)胞類型和患者特異性靶基因的異常剪接，提供了剪接因子RP臨床表型的分子特征。以來源于一名患有非常嚴(yán)重RP的RP11患者的細(xì)胞為材料，作者利用CRISPR/Cas9糾正了其中的PRPF31突變，挽救了分子和細(xì)胞表型，為原位基因糾正的有效性提供了概念上的證據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組測序分析可變剪接

 

致病通路示意圖

事實(shí)上，不僅二代測序可以研究可變剪接，作為具有無需打斷、測序讀長長、定性分析等諸多優(yōu)勢的三代Nanopore，進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序更是研究可變剪接的利器。2015年，研究人員以果蠅的Dscam1基因?yàn)槔?，對其存在?9008種可變剪切形式，利用MinION測序儀檢測到超過7000種可變剪切形式，而這樣的結(jié)果則是利用NGS的測序技術(shù)不能獲得的。2017年，研究人員對單個的鼠B細(xì)胞進(jìn)行測序，并經(jīng)Mandalorion分析，鑒定到數(shù)千個未注釋的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，以及數(shù)百個可變剪切事件。該研究結(jié)果表明，通過Nanopore測序不僅可以識別復(fù)雜的isoforms，而且還能定量其表達(dá)水平（點(diǎn)擊查看詳細(xì)介紹）。

ONT在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，除了可變剪接之外，還有轉(zhuǎn)錄本變異檢測、結(jié)構(gòu)變異檢測、重復(fù)序列變異檢測、HLA分型、甲基化修飾研究、微生物水平應(yīng)用等，詳情可在我們之前盤點(diǎn)的“Nanopore三代測序在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用”中查看哦~

北京百邁客生物科技有限公司與牛津納米孔公司（Oxford?Nanopore Technologies，簡稱ONT）達(dá)成長期合作。截至目前，百邁客已經(jīng)擁有Oxford Nanopore的MinION、GridION X5和PromethION全套Nanopore測序儀。

 

參考文獻(xiàn)

Adriana Buskin et al.Disrupted alternative splicing for genes implicated?in splicing and ciliogenesis causes PRPF31 retinitis?pigmentosa.?Nat Commun，2018 Oct 12;9(1):4234.