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 分類： 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

對(duì)于高通量技術(shù)大家一定都不陌生，但生物信息分析之后該做什么呢？接下來的日子，小編會(huì)和大家探討并分享高通量測(cè)序后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，即該用什么技術(shù)做什么驗(yàn)證！

 

關(guān)于實(shí)驗(yàn)小編也是初來乍到，今天先和大家探討最常見的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后的驗(yàn)證方法。轉(zhuǎn)錄組的驗(yàn)證方法有點(diǎn)多（如表達(dá)量驗(yàn)證、亞細(xì)胞定位、RNA結(jié)合蛋白、功能獲得驗(yàn)證、功能缺失驗(yàn)證等），本篇只先介紹表達(dá)量驗(yàn)證、RNA結(jié)合蛋白、亞細(xì)胞定位，其余的下期見！

表達(dá)量驗(yàn)證

一般情況我們優(yōu)先選擇高表達(dá)量的RNA，以及差異表達(dá)明顯的RNA去驗(yàn)證。去驗(yàn)證某個(gè)基因或者RNA的表達(dá)量時(shí)，需要保證沒有基因組DNA的污染。PS:如果是非編碼RNA驗(yàn)證，由于他們可能不含polyA尾巴，所以要注意反轉(zhuǎn)錄方式。

qRT-PCR

設(shè)計(jì)引物RNA進(jìn)行qRT-PCR。

哈哈哈，如果你和小編一樣曾是生信dog，我相信你一定一臉懵逼，我連PCR到底是啥能干啥都不知道，你跟我說qRT-PCR!

小編以一個(gè)實(shí)驗(yàn)編外人士跟你通俗易懂的科普一下，PCR是設(shè)計(jì)引物判斷某個(gè)DNA序列是否存在的技術(shù)；RT-PCR對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription）得到cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)而判斷某個(gè)RNA序列是否存在的技術(shù)；qPCR不只判斷DNA是否存在，還能判斷含量高低，qRT-PCR即quatitative RT-PCR，是判斷RNA是否存在以及含量高低的技術(shù)！

總結(jié)一句話，PCR都得設(shè)計(jì)引物，帶RT就是研究RNA,不帶RT就是研究DNA，帶q就是定量，不帶q就是定性！至于他是咋定量的呢，劃重點(diǎn)，靠?jī)?nèi)參！！

小編已經(jīng)快被自己總結(jié)能力所折服了！

Northern blot

Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補(bǔ)配對(duì)的探針雜交來檢測(cè)目的片段。PS:?Northern blot樣品需除去RNA酶。

小編再給大家科普一下下，Western Blot做蛋白，Southern Blot做DNA，Eastern blotting是Western Blot的變形也是作蛋白，不過沒得到廣泛認(rèn)可。

靈敏度：qRT-PCR?>?Northern blot
特異性：Northern blot?>?qRT-PCR

RNA和蛋白互作驗(yàn)證

RNA結(jié)合蛋白（RNA?Binding?Protein）是一類伴隨RNA的調(diào)控代謝過程，與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱。RBP伴隨RNA生命始終，其主要作用是介導(dǎo)RNA的成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯；一個(gè)RBP可能存在多種靶標(biāo)RNA；且其表達(dá)缺陷會(huì)造成多種疾病。RNA與蛋白相互作用是RNA功能研究的焦點(diǎn)問題之一。

RNA-pull down

已知RNA，尋找結(jié)合蛋白。

RNA?pull-down實(shí)驗(yàn)就是先將RNA進(jìn)行標(biāo)記（如生物素探針標(biāo)記）再與蛋白共同孵育，從而形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，最后通過WB(western?blot)或質(zhì)譜（mass?Spectrometry）檢測(cè)蛋白質(zhì)。

該技術(shù)用于尋找與目的RNA結(jié)合的蛋白。

RIP

已知蛋白，尋找RNA。

RIP（RNA?Binding?Protein?Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）技術(shù)采用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，經(jīng)分離純化對(duì)RNA進(jìn)行分析。

該技術(shù)用于尋找與目的蛋白結(jié)合的RNA。

EMSA

已知RNA,已知蛋白，判斷是否結(jié)合。

EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，凝膠遷移）技術(shù)是通過凝膠電泳遷移檢測(cè)蛋白-RNA互作的一種技術(shù)。

首先將設(shè)計(jì)好的帶有標(biāo)記的RNA探針與樣本蛋白混合孵育，形成蛋白-RNA復(fù)合物。因復(fù)合物分子量大，會(huì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，來確定RNA結(jié)合蛋白的特異性。

該技術(shù)用于體外驗(yàn)證預(yù)測(cè)的RNA與蛋白之間是否能夠結(jié)合。

亞細(xì)胞定位研究

亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，例如在核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或者細(xì)胞膜上存在。越來越多的證據(jù)顯示，在生物學(xué)過程中位于不同的亞細(xì)胞器RNA擁有不同的功能，亞細(xì)胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能。

RNAFISH

RNAFISH，即RNA的免疫熒光原位雜交，是將已標(biāo)記的RNA探針（可在探針上標(biāo)記熒光基團(tuán)、生物素、地高辛等）與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)RNA中的互補(bǔ)序列雜交,從而對(duì)組織細(xì)胞中的RNA進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。

數(shù)據(jù)庫

小編偷偷的告訴你（雖然有可能你早就知道），RNALocate數(shù)據(jù)庫（http://www.rna-society.org/rnalocate）收錄了超過42,000個(gè)人工收集的RNA的亞細(xì)胞定位信息，包含超過23,100個(gè)RNA，在65個(gè)物種中的42個(gè)亞細(xì)胞定位。lncATLAS數(shù)據(jù)庫（http://lncatlas.crg.eu/）則是一個(gè)專門收錄lncRNA亞細(xì)胞定位的數(shù)據(jù)庫。有需要的可以先去查詢！

休息休息一下~這一期就到這里吧~

下期關(guān)于轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證如功能獲得&缺失、細(xì)胞模型&動(dòng)物模型見！

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參考文獻(xiàn)：

Zhang?T?,?Tan?P?,?Wang?L?,?et?al.?RNALocate:?A?resource?for?RNA?subcellular?localizations[J].?Nucleic?Acids?Research,?2016,?45(Database?issue).

Mas-Ponte?D,?Carlevaro-Fita?J,?Palumbo?E,?Pulido?TH,?Guigo?R,?Johnson?R.?LncATLAS?database?for?subcellular?localization?of?long?noncoding?RNAs.?Rna.?2017?Jul?1;23(7):1080-7.

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