研究背景
單個基因不同轉(zhuǎn)錄本isoform產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有不同的生物特性,包括穩(wěn)定性、細胞內(nèi)定位、酶活性和翻譯后修飾。Isoform是可選擇性轉(zhuǎn)錄起始位點（transcription start sites，TSS）、轉(zhuǎn)錄終點（transcription end sites，TES）和可變剪接事件等的產(chǎn)物。據(jù)預測，大部分人類基因存在可變剪接?？勺兗艚油蛔兣c人類遺傳病和腫瘤均密切相關。故而，不僅需要在基因水平鑒定轉(zhuǎn)錄組多樣性，也需要在轉(zhuǎn)錄本表達水平分析細胞真正的轉(zhuǎn)錄多樣性。二代轉(zhuǎn)錄組測序弊端：目前基于二代平臺的短讀長RNAseq方法在識別復雜轉(zhuǎn)錄本isoform方面存在固有限制，因為它們不能測序全長轉(zhuǎn)錄本。相反，轉(zhuǎn)錄本被片段化以進行測序，其產(chǎn)生的單個短reads無法跨越整個轉(zhuǎn)錄本。算法工具可用于從這些reads中組裝完整的轉(zhuǎn)錄本，但不同的組裝算法可能會導致相互矛盾的結果，整體組裝質(zhì)量良莠不齊。為了克服二代短讀長RNAseq的這種限制，出現(xiàn)了基于三代測序平臺的全長轉(zhuǎn)錄本測序，比如ONT平臺全長轉(zhuǎn)錄組測序技術。研究表明，在看似同質(zhì)的細胞群體中各個細胞在基因表達方面可能不同。細胞間異質(zhì)性使免疫細胞成為深入分析轉(zhuǎn)錄多樣性的靶標。研究目的：通過使用ONT技術對全長cDNA分子進行測序，探究小鼠B1a細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組多樣性。
研究方法
- 小鼠B1a細胞分選：野生C57Bl/6小鼠腹腔灌洗收集細胞，流式分選Ter119?CD3?CD4?CD8?Gr1?B220+IgM+CD11b?CD5+?B1a細胞。（注：B細胞根據(jù)其發(fā)育來源分為B1細胞和B2細胞，根據(jù)是否表達CD5分子B1細胞又分為B1a和B1b細胞2種亞型，其中B1a細胞為CD5+?B細胞，而B1b和B2不表達CD5分子。）
- Smartseq2單細胞全長mRNA擴增合成cDNA
- 7個B1a細胞全長cDNA分別進行二代Illumina轉(zhuǎn)錄組測序（73,086-351,876 150?bp reads/細胞）和三代ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序（R 7.3 17,749-52,696/R9.4 57,874-128,726 ONT reads/細胞），二者間進行比較。
人工合成標準品?Spike-in RNA Variant Control Mixes (SIRVs, Lexogen，根據(jù)7個人類基因結構設計而成的，其中每個基因結構有6-18種轉(zhuǎn)錄本變異，因此總共有69種轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本全面的解決了可變剪接、可變轉(zhuǎn)錄起始點和終止位點、重疊基因和反義轉(zhuǎn)錄問題)，分別進行二代Illumina轉(zhuǎn)錄組測序和三代ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序，二者間進行比較。
研究結果
1、B1a細胞基因表達定量比較
比較相同細胞的Illumina和ONT RNAseq基因表達定量結果，二者間具有高相關性（ONT R7.3芯片的Pearsonr相關系數(shù)≥0.84-0.89和升級版R9.4芯片為0.9-0.92），證實ONT RNAseq方法可復現(xiàn)Illumina基因表達定量。比較不同細胞中的Illumina和ONT RNAseq基因表達定量數(shù)據(jù)顯示，Pearsonr≤0.45的低相關性，表明ONT RNAseq可以鑒定不同細胞間表達差異。
即使產(chǎn)生相對較少的reads數(shù)，ONT RNAseq基因表達定量也檢測到了絕大多數(shù)Illumina RNAseq檢測到的基因（下圖a）。此外，7個細胞中的5個，基因表達檢測已達到飽和（下圖S2）。ONT或Illumina RNAseq單獨檢測到的基因表達水平較低，表明這些基因的表達水平接近兩種技術的檢測下限（下圖b）。還觀察到ONT RNAseq單獨檢測的基因由較短的轉(zhuǎn)錄本組成（下圖c）。此外，長度<600bp并且通過ONT和Illumina RNAseq檢測的基因在Illumina RNAseq數(shù)據(jù)中具有相對較低的表達水平（下圖d）。雖然這與在基于Tn5的Illumina文庫制備中強烈選擇的較短轉(zhuǎn)錄本一致，但不能排除ONT RNAseq可能偏向于較短的轉(zhuǎn)錄本。為排除這種可能性，作者進一步選擇合成轉(zhuǎn)錄本混合物SIRVs，分析轉(zhuǎn)錄本長度是否對ONT RNAseq表達定量有影響。
2、SIRVs合成轉(zhuǎn)錄本混合物2種平臺比較
SIRV為已知長度、結構和序列的人工合成的Spike-in RNA對照混合物。當擴增單細胞級痕量RNA時，較低濃度組中的轉(zhuǎn)錄本drop-out（很多未檢出表達），并且轉(zhuǎn)錄本定量顯示每個濃度組內(nèi)的變化（下圖e，橫坐標為4個不同濃度分組）。然而，重要的是，定量不受轉(zhuǎn)錄本長度的影響，除了短于500bp的轉(zhuǎn)錄本（下圖f）。通常，ONT RNAseq定量與Spike-in?轉(zhuǎn)錄物濃度一致，轉(zhuǎn)錄本定量的組內(nèi)變異在重復樣本之間是可重復的（下圖g）。這種組內(nèi)變異可能是由于初始轉(zhuǎn)錄水平、系統(tǒng)擴增偏差或數(shù)據(jù)分析偏差導致。分析這些不同濃度的合成轉(zhuǎn)錄本使作者排除了ONT RNAseq有利于較短轉(zhuǎn)錄本定量的可能性，可對長度為500-2,500 bp的SIRV轉(zhuǎn)錄本進行大規(guī)模無偏倚定量。
3、SIRVs isoform鑒定及定量
接下來作者評估了ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序是否適用于鑒定SIRVs不同isoform及isoforms表達定量。利用Mandalorion pipeline對TSS、TES和剪切位點進行分類。作者檢測到20個TSS位點和24個TES位點，它們都與實際的TSS和TES直接重疊，并且在SIRV轉(zhuǎn)錄本注釋中存在的38個（/57個）實際TSS和41個（/59個）實際TES的60bp內(nèi)。
此外，在SIRV基因組注釋中檢測到76個（/89個）5’剪接位點和73個（/93個）3’剪接位點。通過分析ONT reads實際剪接模式，作者檢測到11個（/12個）備選3’剪接位點和12個（/14個）備選5’剪接位點，以及12個（/12個）內(nèi)含子保留事件。
根據(jù)其TSS/TES和可變剪接位點的使用將ONT reads分類為isoform組，并生成一致性序列，共計33個一致性序列，與其對應的SIRV轉(zhuǎn)錄本之間具有97.8-100%相似性，且方向一致。26個一致性序列匹配2個高豐度組中存在的29個SIRV轉(zhuǎn)錄本之一（下圖c）。不依賴于基因組注釋的轉(zhuǎn)錄本isoform?Mandalorion分類定量與reads直接與轉(zhuǎn)錄組比對得到的定量結果之間的高度相關性（下圖d）。
4、鑒定單個B1a細胞isoform特征
通過對ONT全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，鑒定到4234個TSS和3883個TES，僅有2476個TSS和2448個TES與小鼠基因組的Gencode數(shù)據(jù)庫（vM10）中存在的TSS或TES重疊。（下圖a）為了確定TSS和TES鑒定的z確性，作者分析了Fantom5數(shù)據(jù)庫中 CAGE peak和polyA信號富集，F(xiàn)antom5 CAGE峰來源于轉(zhuǎn)錄本5’末端的捕獲和測序，因此應在TSS中富集。實際上，與TES（49/3883或1.3％）相比，高比例的注釋（2356/2476或95％）和未注釋（1052/1799或58％）TSS與高得分的Fantom5 CAGE峰重疊（下圖b）。相反，注釋和未注釋的TES都高度富集polyA信號，而TSS則沒有（下圖c）。如預期的那樣，大多數(shù)基因恰好包含一個TSS和一個TES。然而，696個基因含有1個以上的TSS或TES，表明存在一種以上的isoform（下圖d）?？傊?，單個細胞ONT RNA-seq成功鑒定了數(shù)千個未注釋的TSS和TES以及數(shù)百個具有差異TSS/TES使用的基因。
總共鑒定到24,887個5’剪接位點（SS）和24,756個3’剪接位點。絕大多數(shù)這些剪接位點由Illumina junction reads或GENCODE注釋支持。24,298（97.6％）個5’SS和24,220（97.8％）個3’SS分別與GENCODE注釋匹配。在與GENCODE注釋不匹配的589個5’SS和536個3’SS中，分別有250（42.4％）個5’SS和216（40.2％）個3’SS由在Illumina junction reads支持。就算假設所有無GENCODE注釋或Illumina reads支持的剪接位點都是假的（顯然這是不可能的），該方法的錯誤發(fā)現(xiàn)率僅為1.3％（659/49,643）。ONT RNAseq在確定√確剪接位點方面相對成功（上圖e為剪接位點堿基上下文context）。作者發(fā)現(xiàn)了296個內(nèi)含子保留事件，134個可選的5’剪接位點和173個可選的3’剪接位點組合。大多數(shù)這些事件也在Illumina reads中觀察到，illumina reads支持216個（/296個）內(nèi)含子保留事件，99個（/134個）可選5’剪接位點，123個（/173個）可選3’剪接位點和72個（/92個）外顯子跳躍事件（上圖f）。
5、鑒定B1a細胞復雜isoform
表達復雜isoform的基因定義為：含有可變TSS/TES和可變剪接位點的基因。共計鑒定了169種表達復雜isoform的基因。其中55個基因在細胞之間存在高度顯著差異isoform使用，包括B細胞特異性表面受體CD19和CD20，抗體重鏈基因座（IGH）（下圖g-i），CD37（下圖CD37），以及CD2和CD79b，以及CD45。各個B1a細胞中，來自CD19的同種型顯示出可變TSS和內(nèi)含子保留事件的組合。另一方面，來自CD20的同種型顯示出可選擇性TES的組合，以及包括先前未注釋外顯子的外顯子跳躍事件。IGH基因座更復雜，具有包含VDJ重組和IGHM恒定區(qū)外顯子的典型isoform。觀察到了含有IGHM恒定區(qū)外顯子的isoform，但是源自（1）流產(chǎn)性DJ重組（2）I-外顯子（3）IGHM轉(zhuǎn)換區(qū)miRNA基因座（4）J-區(qū)段。最后，細胞1中的一種isoform來自IGHM I-外顯子，但含有IGHD恒定區(qū)外顯子。雖然之前已觀察到IGH isoform多樣性并且長期以來已知其參與類別轉(zhuǎn)換，但ONT RNAseq在單細胞水平上測序全長cDNA的能力確實突出并證實了?IGH基因座特殊的轉(zhuǎn)錄多樣性。
ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序優(yōu)于Illumina數(shù)據(jù)組裝轉(zhuǎn)錄本isoform的優(yōu)勢在于從5’端到3’端測序整個cDNA分子的能力。雖然如果基因座僅表達單個isoform，使用Trinity組裝Illumina數(shù)據(jù)可能會成功，但它似乎很難分析包含多個遠距離替代特征的基因座的多種isoform。例如，ONT RNAseq在所分析的各個細胞中鑒定了CD37基因的幾種不同isoform（上圖CD37）。在大多數(shù)情況下，從單個細胞組裝Illumina數(shù)據(jù)時，Trinity無法形成完整的重疊群或產(chǎn)生ONT RNAseq未檢測到的重疊群。因此，CD37基因及其isoform鑒定突出了ONT RNAseq方法的優(yōu)勢，以確定復雜isoform多樣性，超出了短reads技術的可能性。
小結
參考文獻
Byrne, A., Beaudin, A. E., Olsen, H. E., Jain, M., Cole, C., Palmer, T., … Vollmers, C. (2017). Nanopore long-read RNAseq reveals widespread transcriptional variation among the surface receptors of individual B cells.?Nature communications,?8, 16027. doi:10.1038/ncomms16027?如果您的項目有任何，歡迎點擊下方按鈕咨詢我們。
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