2019年1月23日J(rèn)ournal of Hazardous Materials在線發(fā)表中國(guó)科學(xué)院植物研究所何振艷研究團(tuán)隊(duì)“Potential use of the Pteris vittata arsenic hyperaccumulation-regulation network for phytoremediation”研究論文。本文通過三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組、二代轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析，闡述了蜈蚣草砷超富集調(diào)控機(jī)制。
中文題目：蜈蚣草砷超富集調(diào)控機(jī)制在植物修復(fù)中的潛在應(yīng)用
英文題目：Potential use of the Pteris vittata arsenic hyperaccumulation-regulation network for phytoremediation
發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials
影響因子：6.434
研究背景
砷是一種自然界廣泛存在的有毒類金屬元素。隨著人類和科技的發(fā)展，農(nóng)藥、采礦等行為對(duì)土壤造成了嚴(yán)重的砷污染。砷可通過食物鏈從土壤富集到人體中，對(duì)人體造成極大的傷害。為保護(hù)人類健康，維護(hù)糧食安全，亟需對(duì)土壤砷污染進(jìn)行治理。近年來，以砷超富集植物蜈蚣草為基礎(chǔ)的植物修復(fù)技術(shù)，為砷污染土壤的修復(fù)提供了新的低成本和環(huán)境友好的治理策略。
蜈蚣草是一種砷超富集的模式作物，具有極強(qiáng)的砷抗性和富集能力。據(jù)統(tǒng)計(jì)，蜈蚣草地上部分砷富集量可達(dá)23 g/ kg，且不影響其正常生長(zhǎng)，是價(jià)值極高的植物修復(fù)材料。目前，蜈蚣草組學(xué)信息的缺乏已成為其砷超富集機(jī)制研究的瓶頸，超富集過程關(guān)鍵分子元件的未知，極大的限制了植物修復(fù)技術(shù)的研發(fā)和推進(jìn)。
研究材料及方法
研究材料：蜈蚣草孢子體收集于湖北武漢，并在無砷培養(yǎng)土中長(zhǎng)至10cm左右。
研究方法：使用2 mM As(III) (NaAsO2)或2 mM As(V) (NaH2AsO4)作為試驗(yàn)組進(jìn)行水培處理，24h后分別采集根部和地上部進(jìn)行測(cè)序。
測(cè)序平臺(tái)：北京百邁客生物科技有限公司Illumina及Pacbio測(cè)序平臺(tái)。
研究結(jié)果
1 構(gòu)建蜈蚣草“全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組-液泡膜蛋白質(zhì)組”數(shù)據(jù)庫
SR-uXRF掃描結(jié)果顯示，使用As(III)/As(V)處理24h后，蜈蚣草可迅速吸收并將砷積累到體內(nèi)。本研究使用PacBio RS-II 測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建1-2、2-3和3-6 Kb三個(gè)文庫共8個(gè)cell，其測(cè)序長(zhǎng)度最長(zhǎng)達(dá)50kb，平均長(zhǎng)度3,111bp。使用Illumina 二代測(cè)序平臺(tái)共計(jì)獲得521M雙端reads,平均長(zhǎng)度為924bp。通過蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序分析，共計(jì)獲得13,595個(gè)液泡膜肽段，可以匹配到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的1,512個(gè)轉(zhuǎn)錄本。與NGS測(cè)序技術(shù)相比，使用Pacbio進(jìn)行三代測(cè)序可獲得更為完整的轉(zhuǎn)錄本，得到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量少但平均長(zhǎng)度更長(zhǎng)。使用二代數(shù)據(jù)對(duì)三代數(shù)據(jù)進(jìn)行校正后其轉(zhuǎn)錄本的質(zhì)量從0.598提升至0.906。綜上所述，在使用As(III)/As(V)處理后，共計(jì)獲得 69,615轉(zhuǎn)錄本，381個(gè)lncRNAs，1,482個(gè)可變剪切及1,512個(gè)可匹配轉(zhuǎn)錄本的肽段。將以上信息進(jìn)行整合，構(gòu)建了蜈蚣草“全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組-液泡膜蛋白質(zhì)組”數(shù)據(jù)庫。
圖1 不同處理下蜈蚣草砷累積水平及“全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組–蛋白組”數(shù)據(jù)庫構(gòu)建工作流程
2 As(III)/As(V)處理?xiàng)l件下蜈蚣草基因表達(dá)譜
對(duì)不同處理不同組織部位進(jìn)行兩兩比較（CKS-As(III)S、CKR-As(V)S、CKS-As(III)R和CKRAs(V)R），共計(jì)獲得4,601個(gè)差異表達(dá)基因。通過K-means算法進(jìn)行富集分析，6個(gè)cluster中的共2,997（65.1%）個(gè)DEGs在根和地上部出現(xiàn)相反的表達(dá)模式：其中k1、k3、k4和k6以地上部表達(dá)模式為主，其生物學(xué)功能包括光合作用等；而k2和k5以根部表達(dá)模式為主，參與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。
WGCNA組分分析可知，粉色和紫色模塊的地上部與As(III)處理顯著相關(guān)，根部模塊中綠色和紫色模塊與As(III)處理顯著相關(guān)，粉色模塊與As(V)處理的地上部顯著相關(guān)，棕色模塊與As(V)處理的根部顯著相關(guān)。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，在所有的砷處理樣品中，均富集到GSH代謝（ko00480）和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體（ko02010）兩個(gè)通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工過程（ko04141）主要富集在砷處理的根部樣品中。因此，這些通路可能在蜈蚣草的砷超富集過程中扮演重要作用。
圖2 K-means聚類及WGCNA組分分析
本研究共鑒定到包括已知PvTIP4;1、PvACR3和PvACR3;1在內(nèi)的共2,248個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)受體基因，其中226個(gè)與砷脅迫相關(guān)。與砷相關(guān)的絕大多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)受體與6個(gè)高表達(dá)的基因家族有關(guān)，包括ACR3 superfamily、ABC superfamily、MFS superfamily、P-type ATPase、NRT3 superfamily和MIP superfamily。其中ACR3 superfamily和ABC superfamily基因家族基因在砷處理樣品中表達(dá)量上調(diào)，MFS superfamily基因家族基因在根部As(V)處理組和地上部As(III)處理組表達(dá)量上調(diào)，P-type ATPase基因家族在地上部As(III)處理組表達(dá)量上調(diào)，NRT3 superfamily基因家族在根部As(V)處理組表達(dá)量上調(diào)，而MIP superfamily基因家族在As(III)S和As(V)R中表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族對(duì)砷的轉(zhuǎn)運(yùn)起到重要作用。
通過使用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建蛋白數(shù)據(jù)庫，對(duì)液泡膜蛋白進(jìn)行重新注釋，共找到13,595液泡膜蛋白肽段，比對(duì)到1,512個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中鑒定到包括P-type ATPase、MIP、MFS、ABC、丙糖-磷酸鹽和賴氨酸-蘇氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)受體8等6個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)家族在內(nèi)的119個(gè)液泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其中有四個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族表現(xiàn)出高表達(dá)水平且與砷處理應(yīng)答有關(guān)：絕大多數(shù)的 MIP和P-type ATPase轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有著更高的表達(dá)水平，而ABC和 MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則在砷刺激后在地上部或根部表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在液泡膜上對(duì)砷的超富集起到重要作用。
本研究表明，錯(cuò)誤折疊蛋白降解和GSH代謝途徑在砷處理相關(guān)模塊中富集，為蜈蚣草的砷抗性機(jī)制提供了新思路。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路（ERAD, ko04141）在所有與砷處理相關(guān)的模塊中顯著富集程度最高。重金屬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白錯(cuò)誤折疊而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解通路（ERAD）和泛素蛋白酶體通路（UPP）可降解錯(cuò)誤折疊蛋白的合成而維持細(xì)胞健康。在進(jìn)行砷處理后，所有與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因并未被激活，而參與ERAD和UPP通路的基因則表達(dá)量上調(diào)，且根部基因表達(dá)水平高于地上部。根部是直接與環(huán)境中的砷接觸部位，其錯(cuò)誤蛋白降解能力的提高，可保證根部的正常代謝，進(jìn)而賦予其較強(qiáng)的砷抗性。
GSH代謝通路也在所有的砷處理樣品中富集。在植物中，GSH可作為抗氧化劑阻止ROS損傷。在本研究中，GSH合成的兩個(gè)關(guān)鍵酶GSH1和GSH2并未明顯受到砷處理的影響，而GST轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量則在砷處理后顯著上調(diào)。GST可通過谷胱甘肽與亞砷酸鹽結(jié)合而介導(dǎo)砷-硫醇化合物的形成。蜈蚣草有著很強(qiáng)的砷-GSH絡(luò)合物的合成能力，但其絡(luò)合物量卻很少，因此有可能存在高效的“As(GSH)3絡(luò)合-區(qū)隔化-降解”過程。一旦As(GSH)3進(jìn)入液泡而GST不足，由于砷-硫醇類化合物的高度不穩(wěn)定性，可能發(fā)生不可逆降解，從而使得As(GSH)3含量很低。而蜈蚣草高效的‘砷絡(luò)合-區(qū)隔化’系統(tǒng)能阻止細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的砷損害，進(jìn)而增加蜈蚣草對(duì)砷的抗性。
本研究共鑒定到1,482個(gè)可變剪接事件，并分為六類包括：內(nèi)含子保留（RI）、外顯子跳躍（SE）、最后外顯子可變剪切（AL）。第一外顯子可變剪切（AF）、3’端可變剪接位點(diǎn)（A3）和5’端可變剪接（A5）。WGCNA分析結(jié)果共分為四個(gè)模塊（橙色、綠色、藍(lán)色，灰色）。在地上部，所有樣本都與橙色模塊相關(guān)，而在根部，綠色模塊與As(III)R顯著相關(guān)，藍(lán)色模塊與AS(V)R顯著相關(guān)。對(duì)不同模塊進(jìn)行KEGG富集分析得知，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路和GSH代謝兩個(gè)最重要的通路，顯著富集在綠色模塊。通過PCR對(duì)相關(guān)可變剪切進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明可變剪切極大的豐富了轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，在錯(cuò)誤折疊蛋白降解過程和GST的表達(dá)上起調(diào)控作用。
總結(jié)
小編寄語
全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序利用Nanopore或Pacbio三代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行的測(cè)序，可借助其超長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，無需組裝，直接獲得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，準(zhǔn)確鑒定基因的可變剪接、APA、融合基因、基因家族和非編碼RNA等信息。此外，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析是近兩年研究熱點(diǎn)，一方面可以構(gòu)建蛋白搜索數(shù)據(jù)庫，全面準(zhǔn)確地對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定和定量；另一方面對(duì)可變剪切事件進(jìn)行相互驗(yàn)證。
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