單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)之：10× Genomics技術(shù)及優(yōu)缺點(diǎn)

小編之前已經(jīng)跟大家簡單介紹過了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的一些相關(guān)知識，并提到了在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組前期，主要依賴三種方法：SMART-seq2技術(shù)、10×genomics技術(shù)及Andeplete技術(shù)。? 現(xiàn)在就跟大家詳細(xì)介紹一下其中10×genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序優(yōu)缺點(diǎn)。

10x Genomics單細(xì)胞技術(shù)

ChromiumTM Single Cell 3′ Solution是基于10 X Genomics平臺(tái)，能夠一次性分離、并標(biāo)記500–10000個(gè)單細(xì)胞，并能在單細(xì)胞水平進(jìn)行檢測的技術(shù)，其通過微流控系統(tǒng)，將單細(xì)胞或長片段DNA分子快速分配到油包水的微反應(yīng)體系中，每個(gè)微反應(yīng)體系中的單DNA分子會(huì)獲得唯一的特異性分子標(biāo)簽，制備生成的測序文庫可以在illumina平臺(tái)進(jìn)行測序，并由10x Genomics提供數(shù)據(jù)分析及可視化軟件，測序?qū)嶒?yàn)及分析流程可以和illumina系統(tǒng)無縫銜接。該平臺(tái)廣泛應(yīng)用于3’單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、基因組組裝應(yīng)用、免疫組庫測序、ATAC-seq、人全基因組及全外顯子組測序。

10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序有效地解決了組織樣本無法破解的細(xì)胞異質(zhì)性難題，有助于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型；并基于大量的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)，可以提供細(xì)胞表達(dá)特征聚類、亞群表達(dá)特征的分析、標(biāo)志物篩選等方面的分析，是一種高效的單細(xì)胞基因表達(dá)水平檢測技術(shù)。

10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序優(yōu)缺點(diǎn)

 

10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序優(yōu)點(diǎn)

1、簡單便捷：集單細(xì)胞分選、擴(kuò)增、建庫于一體；

2、細(xì)胞通量高：每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)可達(dá)500-10000個(gè)；

3、建庫周期短：1天可完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、擴(kuò)增及建庫；

4、超高捕獲效率：單細(xì)胞捕獲效率高達(dá)65%；

5、真正意義的單細(xì)胞：單個(gè)液滴捕獲到多個(gè)細(xì)胞的概率極低（0.9%/1000cells）；

6、價(jià)格實(shí)惠：相較于其它單細(xì)胞平臺(tái)，價(jià)格實(shí)惠。

10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序缺點(diǎn)

1、非全長信息：只能獲得3’端轉(zhuǎn)錄本信息；

2、樣本要求高：單個(gè)樣本細(xì)胞起始量達(dá)10^5-10^6個(gè)，活細(xì)胞數(shù)目需超過80%，建議在90%以上最佳。

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10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序流程

 

單細(xì)胞懸浮液制備

↓

細(xì)胞質(zhì)檢

↓

10 X genomics 標(biāo)記cDNA 片段化

↓

文庫構(gòu)建

↓

Illumina 測序

↓

數(shù)據(jù)分析

單細(xì)胞樣本檢測

將樣本制成單細(xì)胞懸浮液，用Countess? II Automated Cell Counter 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活率測定，細(xì)胞活性高于80%，并將細(xì)胞濃度調(diào)整到理想濃度（1000個(gè)/μL）。

實(shí)驗(yàn)流程

1）將制備好的單細(xì)胞懸浮液與含有barcode信息的凝膠珠以及酶的混合物結(jié)合，然后在微流體“雙十字”中進(jìn)行液滴包裹，從而形成GEMs（Gel Bead-In-EMulsions），有效GEMs中包含膠珠（膠珠中有預(yù)制的10x引物）、單細(xì)胞、和Master Mix。然后，在GEMs內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞裂解和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。有效GEMs中，10X Barcode將與cDNA產(chǎn)物連接在一起，接下來再將GEMs破碎并打碎油滴，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，cDNA擴(kuò)增完成以后，針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢（擴(kuò)增片段大小以及擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量）。

2）擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢合格以后，進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建。首先利用化學(xué)方法將cDNA打斷成200-300bp 左右的片段，cDNA片段化、末端修復(fù)和加A，進(jìn)行cDNA片段篩選，P7 Adaptor接頭連接并通過PCR擴(kuò)增引入樣品Index，最后進(jìn)行片段篩選從而得到cDNA文庫。

3）文庫完成以后進(jìn)行庫檢，庫檢合格以后，利用Illumina測序平臺(tái)進(jìn)行測序，獲得測序數(shù)據(jù)，并進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

 

10x Genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用方向

 

核心：細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間差異表達(dá)基因的檢測

多種細(xì)胞類型：組織類細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血液細(xì)胞、癌組織細(xì)胞、神經(jīng)類細(xì)胞等

?廣泛應(yīng)用方向：免疫方向、腫瘤方向、病理分型、干細(xì)胞方向、發(fā)育生物學(xué)（神經(jīng)、腦、胚胎等）、細(xì)胞圖譜繪制……

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10x Genomics作為單細(xì)胞領(lǐng)域的后起之秀，巧妙使用了Barcoding（條形碼）和Microfluidics（微流體）技術(shù)，在單細(xì)胞分離、擴(kuò)增原理上具有明顯的優(yōu)勢。為科研需要提供了高質(zhì)量的技術(shù)支持，如果大家想要了解關(guān)于10x Genomics 單細(xì)胞技術(shù)的更多內(nèi)容，請點(diǎn)擊這里：>>10x Genomics 單細(xì)胞技術(shù)

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