在鹽刺激下對耐鹽擬諾卡氏菌YIM 90087T進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和四氫嘧啶分析

回顧2018，百邁客轉(zhuǎn)錄調(diào)控項目文章收獲頗豐：據(jù)不完全統(tǒng)計，已突破百篇，累積影響因子300+，涉及轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、全長轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、降解組和原核轉(zhuǎn)錄組等。本次項目文章分享中，我們一起走進微小生物世界，去看一看里面的大乾坤~

研究背景

擬諾卡氏菌種是從鹽湖或堿性環(huán)境中分離出來的，其中有約三分之二的菌種嗜鹽或耐鹽。在高鹽環(huán)境下，擬諾卡氏菌可通過加固細胞壁和積累滲透因子等多種方式而使自身得以生存。鹽刺激條件下，滲透因子的累積可使得菌體在不影響其基本細胞進程和常規(guī)代謝的情況下而保持菌體滲透平衡。其中在自然界含量最多的滲透因子便是四氫嘧啶，其可促進蛋白折疊，并保護酶、核酸、抗體等生物分子，使細胞可應(yīng)對多種壓力環(huán)境。在所有的擬諾卡氏菌種中都有參與四氫嘧啶合成的相關(guān)基因。

材料方法

試驗材料：菌種（Nocardiopsisgilva?YIM 90087^T）

試驗內(nèi)容：

1、使用不同鹽濃度（0~15%）處理，觀察N.gilva?YIM 90087^T的形態(tài)學(xué)變化、增殖、四氫嘧啶及羥基四氫嘧啶檢測，進行表型測定

2、提取中期對數(shù)期YIM 90087^T菌體RNA，進行轉(zhuǎn)錄組測序

測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司?Illumina Hiseq

研究結(jié)果

1、鹽含量對N. gilva?YIM 90087T的形態(tài)學(xué)和增殖情況影響

隨著鹽濃度的增高，菌落顏色由黃色變?yōu)榘咨?，且?%的NaCl鹽溶液中生長最佳，鹽濃度高于或低于該濃度，其生長速度均會下降。

 

圖1、菌體表型觀察及生長曲線

2、差異表達分析

對菌種進行二代測序，篩選FDR<0.01，F(xiàn)old Change≥2的基因為差異表達基因，并使用COG、GO、KEGG、Swissport和NR數(shù)據(jù)庫進行注釋分析。通過COG分類，共獲得25個COG組別，其中氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝是其主要組分。DEGs被分布在34個GO term里，其中包括細胞組分、分子功能和生物過程三大類。與此同時，三個比較組（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）差異表達基因分別富集到77、32和90條KEGG通路中，其中ABC轉(zhuǎn)運受體，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝在鹽刺激下扮演相當重要的角色。尤其在最大耐受度的NaCl鹽環(huán)境里，參與ABC轉(zhuǎn)運受體通路的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶基因、甜菜堿基因和四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因表達量都顯著提高。

圖2、三個比較組的（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）COG注釋

3、N. gilva?YIM 90087^T菌種ect基因集的遺傳組成

對四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因ectABCD進行種屬分析。其中在18個擬諾卡氏菌系中存在2個常見的ectABCD基因簇類型。ectABC屬于一個基因簇，而ectD則位于基因組的其他位置（type A, 15 strains），又或者ectABCD歸屬于相同的基因簇（type B, 3 strains）。此外，在N. potens?DSM 45234和N.prasina?DSM 43845菌系中發(fā)現(xiàn)至少一個ectAB或ectD基因。然而，在N.gilva?YIM 90087^T中，基因簇類型卻與其他菌系顯著不同。ectA基因完全與ectBCD基因簇分開，且ehuABCD（四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶ABC轉(zhuǎn)運受體基因）位于ectD基因的下游。

圖3、四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因基因簇

4、參與四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成和轉(zhuǎn)運基因的表達情況

對不同鹽環(huán)境下的參與四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成和轉(zhuǎn)運基因的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的升高，參與四氫嘧啶合成的基因有不同程度的上調(diào)，尤其在15%的鹽濃度中最顯著。與其他基因不同的是，ectD基因從5%到10%和10%到15%鹽濃度下出現(xiàn)兩次上調(diào)。在N. gilva?YIM 90087^T中發(fā)現(xiàn)有兩個特殊的ABC受體基因（ehuABCD和?proXWV）參與四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運，并隨著鹽濃度的升高而發(fā)生變化。ehuABCD表達情況與鹽濃度在大于5%以上時成正相關(guān)，而proXWV的表達量變化在耐受鹽濃度環(huán)境中無變化。有趣的是，ehuABCD和proXWV基因在最大耐受鹽濃度中表達活性最高。

表1、在不同鹽濃度刺激下四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成與轉(zhuǎn)運基因的表達情況

5、N. gilva?YIM 90087^T中四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的累積

使用HPLC對四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶含量進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)這兩種物質(zhì)的含量變化會隨著時間累積，且積累程度隨著NaCl濃度的升高而增加。值得注意的是，羥基四氫嘧啶在0或5% NaCl濃度下很難被合成；而48h后，在10%和15%的NaCl培養(yǎng)基中被檢測到。此外，這兩種物質(zhì)含量均會隨著培養(yǎng)時間的增長而增加。96h后，在15%的NaCl濃度培養(yǎng)下，四氫嘧啶（33.14 mg/g CDW）和羥基四氫嘧啶（1.17 mg/g CDW）達到最高水平。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的含量要比羥基四氫嘧啶的含量分別高42.6和28.3倍。這些結(jié)果表明，四氫嘧啶會在N. gilvaYIM 90087^T的胞內(nèi)累積。

除此之外，對胞外的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶含量進行檢測并發(fā)現(xiàn)大量的四氫嘧啶被釋放到細胞外。96h后，在0、10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，分別釋放了89.20%、92.46%、91.99%和71.09%的四氫嘧啶。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，有99.31%和99.08%的羥基四氫嘧啶被釋放到胞外。在15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運能力顯著增強，而羥基四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運能力則隨著濃度的增加未出現(xiàn)顯著變化。此外，研究表明，將四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為羥基四氫嘧啶的能力會隨著鹽濃度的增加而增強，在15%的鹽濃度環(huán)境下，有50%的四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為羥基四氫嘧啶，并在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的胞外含量最高。

圖4、N. gilva?YIM 90087^T菌種中四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的產(chǎn)生統(tǒng)計

6、外源四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶對N.gilva?YIM 90087^T生長的影響

在鹽刺激下，添加外源的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶會促進菌種的生長速度。在最適宜的鹽濃度環(huán)境下，添加四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶會輕微促進OD₆₀₀值，而在高濃度鹽環(huán)境下，外源物會顯著促進OD₆₀₀值。其中添加外源羥基四氫嘧啶對菌種的生長速度促進作用優(yōu)于外源四氫嘧啶。

7、大腸桿菌中四氫嘧啶累積

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)在15%的NaCl緩沖液中，四氫嘧啶很難產(chǎn)生，并在0%的緩沖液中檢測到少量四氫嘧啶。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的合成速率分別在24h和48h中顯著下降，其最大合成速率為[0.5 mg (g CDW)^?1?h^?1]，而最終產(chǎn)出[28.85 mg (g CDW)^?1]?。

總結(jié)

本文通過對N.gilva?YIM 90087^T在不同鹽濃度環(huán)境下的綜合分析，發(fā)現(xiàn)鹽刺激可導(dǎo)致菌落顏色發(fā)生變化。添加外源的四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶，在高濃度鹽環(huán)境下，可對N. gilva?YIM 90087^T起到保護作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的合成和累積可調(diào)控滲透壓力，并隨著NaCl濃度的升高合成量增大。

 

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