蔬菜基因定位經(jīng)典案例解析【文獻(xiàn)原文下載】

案例一
SLAF-圖譜+SLAF-BSA聯(lián)合解析無參物種豌豆葉形性狀遺傳位點(diǎn)

葉形是影響豌豆光合利用率與產(chǎn)量質(zhì)量的重要農(nóng)藝性狀，本研究聯(lián)合運(yùn)用SLAF-seq高密度遺傳圖譜與SLAF-BSA兩種方法快速挖掘葉形性狀遺傳位點(diǎn)。利用145個(gè)F2單株構(gòu)建SLAF-遺傳圖譜，7146個(gè)上圖標(biāo)簽， 總圖距1120.81cM，平均圖譜為 0.16cM。結(jié)合F2代表型數(shù)據(jù)利用此圖譜共挖掘到兩個(gè)葉形QTL（qLeaf_or-1, qLeaf_or-2），并進(jìn)一步運(yùn)用SLAF-BSA的方法驗(yàn)證到這兩個(gè)位點(diǎn)與葉形性狀緊密關(guān)聯(lián)，并檢測(cè)到許多其他與葉形性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。此外，利用這些SLAF標(biāo)簽序列與蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、大豆基因組進(jìn)行近緣物種共線性分析，發(fā)現(xiàn)無參物種豌豆與蒺藜苜蓿更為相近。因此，本研究證明SLAF-遺傳圖譜和SLAF-BSA聯(lián)合分析是一種可用于無參物種重要性狀遺傳位點(diǎn)解析的經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、高效的方法。

圖1 葉形性狀關(guān)聯(lián)QTL與SLAF標(biāo)簽

——案例2——
SLAF-遺傳圖譜挖掘黃瓜廣譜抗性基因STAYGREEN

黃瓜Gy14對(duì)霜霉病、細(xì)菌性角斑病及真菌性炭疽病等均表現(xiàn)抗病性，然而黃瓜這一廣譜性抗病能力背后的分子遺傳基礎(chǔ)尚不清楚。本研究利用百邁客SLAF-遺傳圖譜并結(jié)合圖位克隆與局部關(guān)聯(lián)分析的方法，成功定位到一個(gè)黃瓜廣譜抗性基因SGR，然而前人研究已經(jīng)表明SGR編碼鎂離子去螯合酶，參與葉綠素降解途徑，是一個(gè)在植物中高度保守的基因；但是本研究發(fā)現(xiàn)在CsSGR編碼區(qū)存在一個(gè)非同義SNP位點(diǎn)（氨基酸：Q108R），引起SGR domain區(qū)縮短的β-折疊片，導(dǎo)致葉綠素降解途徑相關(guān)基因在抗病與感病株系間的差異性表達(dá)，進(jìn)而通過抑制葉綠素降解途徑中ROS與植物性毒素過量積累，從而實(shí)現(xiàn)黃瓜廣譜抗病的能力。這一研究發(fā)現(xiàn)高度保守基因CsSGR的新功能并將加速黃瓜育種進(jìn)程。

圖2 dm1/psl位點(diǎn)圖位克隆與精細(xì)定位
注：a~c為精細(xì)定位過程，d為DNA序列比對(duì)，e為蛋白質(zhì)序列比對(duì)

——案例3——
SLAF-BSA解析黃瓜耐水淹機(jī)制

下胚軸形成不定根是植物適應(yīng)水淹脅迫的一種重要形態(tài)特征，然而，有關(guān)它的分子遺傳基礎(chǔ)仍舊是零散、不系統(tǒng)的。本研究利用SLAF-BSA結(jié)合SNP單體型分析與基因精細(xì)定位的方法，從一個(gè)主效QTL?ARN6.1中鑒定到一個(gè)候選基因，它能夠通過增加不定根的形成，增強(qiáng)黃瓜Zaoer-N耐漬能力。多組證據(jù)表明CsARN6.1是ARN6.1最可能的候選基因，其編碼一個(gè)AAA-ATPase；淹水導(dǎo)致Zaoer-N不定根數(shù)目增加是由于這個(gè)基因編碼的蛋白中存在一個(gè)卷曲螺旋domain，其中一個(gè)非同義SNP變異導(dǎo)致氨基酸的替換，因而CsARN6.1通過調(diào)控ATPase活性來增加不定根數(shù)目。另有證據(jù)也表明，當(dāng)CsARN6.1在擬南芥中異位表達(dá)時(shí)可促進(jìn)生根以及側(cè)根發(fā)育。與野生型黃瓜相比，表達(dá)CsARN6.1^Asp等位的轉(zhuǎn)基因黃瓜在淹水條件下具有顯著增加的不定根數(shù)目?？傊?，以上數(shù)據(jù)表明AAA-ATPase基因CsARN6.1在增加黃瓜不定根數(shù)目以及耐漬性方面具有重要功能。

圖3 SLAF-BSA分析與黃瓜ARN6.1位點(diǎn)精細(xì)定位

——案例4——
重測(cè)序遺傳圖譜挖掘西瓜果實(shí)性狀相關(guān)QTL位點(diǎn)

西瓜是重要的園藝作物，在全世界范圍內(nèi)被廣泛種植，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為解析西瓜重要性狀遺傳位點(diǎn)并分析該物種的遺傳與基因組信息，本研究利用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)親本及RIL群體的126個(gè)株系測(cè)序，共檢測(cè)到178762個(gè)SNP標(biāo)記，其中103,029?個(gè)SNP標(biāo)記被劃歸為2132個(gè)重組bin，遺傳距離總長(zhǎng)為1508.94 cM,?相鄰bin間的平均圖距為0.74 cM?；谶@張圖譜結(jié)合表型數(shù)據(jù)，檢測(cè)到控制果實(shí)苦味，皮色與種皮顏色的3個(gè)主效QTL遺傳位點(diǎn)，具有較高的表型貢獻(xiàn)率。因此，西瓜遺傳圖譜的構(gòu)建與遺傳位點(diǎn)的挖掘是候選基因定位，圖位克隆，比較基因組作圖以及分子標(biāo)記輔助育種的有效方法與途徑。

圖4?西瓜果實(shí)性狀QTL定位

——案例5——
SLAF-BSA定位菠菜霜霉病抗病基因

菠菜霜霉病是全球性的一種致命性病害，而抗霜霉病基因的有效利用是病害防治的最根本而有效途徑，因此本研究對(duì)報(bào)道的菠菜抗病基因RPF1精細(xì)定位。在研究中，作者利用菠菜抗霜霉病品種12S3和感病品種12S4，構(gòu)建F2群體與BC1群體，并通過SLAF-seq對(duì)BC1群體的2個(gè)極端混池?(50+50)?測(cè)序，經(jīng)過BSA分析得到Chr.3上1.72Mb的區(qū)間，此區(qū)間與之前SLAF-遺傳圖譜的定位結(jié)果一致；接著，利用此區(qū)間的SLAF標(biāo)簽篩選重組單株，并將區(qū)域縮小到0.89?Mb；根據(jù)注釋信息發(fā)現(xiàn)這個(gè)區(qū)間存在14個(gè)抗性基因。為了鑒定到這個(gè)基因，作者又對(duì)2個(gè)抗病自交系與3個(gè)感病自交系重測(cè)序，通過序列比對(duì)，最終篩選到3個(gè)最可能的候選基因，而qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)其中的2個(gè)基因存在表達(dá)差異，這就暗示RPF1基因的確定近在眼前。然而這篇文章就到此為止了，但是作者還在做轉(zhuǎn)基因方面的驗(yàn)證工作，相信會(huì)有突破性進(jìn)展。

圖5??RPF1定位分析

? ? ? 此外值得一提的是，去年在BMC Genomics上有一篇文章就是利用的SLAF-遺傳圖譜+SLAF-BSA的方法定位了性別相關(guān)基因，沒錯(cuò)，這兩篇文章用的是同一張SLAF-遺傳圖譜，讓我們期待作者利用這張圖譜挖掘到更多性狀的遺傳信息，并獲得突破性進(jìn)展吧！

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