成功案例 | 百邁客助力草莓果色基因克隆

草莓枝葉和果實的顏色是由于液泡中的花青素積累形成的，但影響花青素積累的基因調(diào)控機(jī)制研究較少。近日，Journal of Experimental Botany在線發(fā)表了百邁客與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室康春穎教授的合作文章，該研究以BSA混池測序的方法為基礎(chǔ)對野生草莓種突變體進(jìn)行分析，成功克隆到影響葉片和果實著色的RAP基因并對其功能進(jìn)行驗證，下面圖譜君就為您帶來該文章的解讀。

 

基因定位材料與方法

材料：

親本YW5AF7（野生型）和rap（ENU突變體）

F2群體，27（野生表型）+18（突變表型）混池；

測序平臺：Illumina HiSeq X Ten

關(guān)聯(lián)方法：SNP index

驗證方法：PCR擴(kuò)增 + Sanger測序

 

結(jié)果分析

1. 表型鑒定

作者利用ENU誘變產(chǎn)生了綠色葉柄和葉片的突變體rap，相較與野生型YW5AF7，rap表皮細(xì)胞的色素沉著大大減少，葉柄的橫截面脈管系統(tǒng)周圍皮層細(xì)胞中顯示出相同的變化，且與色素減少表型相一致的是rap葉片葉柄中總花青素含量顯著降低（P <0.01），rap和YW5AF7對照果實中花青素含量都極低（圖1）。通過對已知花青素合成途徑相關(guān)基因表達(dá)及測序分析，RAP為一新基因參與花青素的積累，調(diào)控草莓的生長發(fā)育。

圖1 表型鑒定

2. 基因定位

利用rap與YW5AF7雜交產(chǎn)生F2群體，突變體與野生型植物的比例接近1：3，說明rap由隱性單位點控制。應(yīng)用BSA方法，將F2群體18株突變表型及27株野生表型植株植物全基因組重測序，在突變體和野生混池中分別獲得43.3M和48.5M reads。共找到64個SNP位點與表型相關(guān)聯(lián)。其中，在基因間區(qū)域有41個，內(nèi)含子有11個，UTR有3個，編碼序列有9個。作者重點關(guān)注了9個編碼區(qū)的SNP差異（圖2），其中8個位點導(dǎo)致同義突變或錯義突變，僅一個SNP（C到T）導(dǎo)致基因31672的提前終止，通過PCR擴(kuò)增和Sanger測序在50個F2 rap突變體中單獨檢測該SNP，所有個體都均表現(xiàn)出純合突變。此外，RAP的表達(dá)水平在rap葉柄中大大降低，將gene31672確定為RAP主要的候選基因。

圖2 突變位點及表達(dá)量檢測

3. RAP 功能研究

RAP 編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST），F(xiàn). vesca中有的7個GST同源基因，它們被命名為RAP-L1到RAP-L7，qRT-PCR表達(dá)量分析表明，RAP主要在果實中表達(dá)較高。為了探索它們對果實著色的貢獻(xiàn)，分別在果實成熟的過程的4個發(fā)育階段檢測RAP與其它同源基因的表達(dá)趨勢，RAP-L4在綠色階段是表達(dá)最豐富，RAP從著色階段開始表達(dá)，且表達(dá)量較高（圖3）。

圖3 表達(dá)量檢測

以上結(jié)果表明RAP相比與其它同源基因，在草莓著色發(fā)育階段發(fā)揮更重要的作用，構(gòu)建35S::RAP-RFP 載體轉(zhuǎn)化rap 同源突變體tt19-7，可以互補(bǔ)tt19-7表型，RAP-RNAi 轉(zhuǎn)化材料和對照相比，花青素含量降低，研究發(fā)現(xiàn)RAP位于果實特異轉(zhuǎn)錄因子FvMYB10的下游發(fā)揮作用，調(diào)控果實顏色。

總結(jié)

本文應(yīng)用F2群體中27+18的混池BSA分析，通過對候選區(qū)段SNP注釋分析，成功克隆到RAP基因，它編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，參與草莓葉柄及果實花青素的積累，調(diào)控葉色及果色形成，后期可用于草莓果色輔助性育種。

 

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