番茄中cf -10介導的C. fulvum感染的防御反應機制解析

英文題目：Physiological and RNA-seq analyses provide insights into the response
mechanism of the Cf-10-mediated resistance to Cladosporium fulvum
infection in tomato
中文題目：生理和RNA-seq研究解析番茄中cf -10介導的C. fulvum感染的防御反應機制
發(fā)表雜志：Plant Molecular Biology，2018.01

1.研究背景
葉霉是由活體營養(yǎng)菌Cladosporium fulvum（C. fulvum）引起的，是影響番茄的最常見疾病之一。番茄與C. fulvum病原體的相互作用遵循典型的gene-for-gene關系。根據(jù)這一關系，一個C. fulvum效應基因產(chǎn)生的該基因本身或其調節(jié)的宿主靶向基因會被對應的番茄C. fulvum抗性基因的產(chǎn)物所感應，如Avirulence基因。番茄的Cf系列基因是一類重要的C. fulvum抗性基因，可與C. fulvum Avr基因相匹配，激活防御基因的表達并觸發(fā)HR。Cf系列基因包括Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9和Cf-10，對于Cf -19和Cf -12以及它們如何介導抗性反應方面的研究較多，但Cf-10介導的抗性反應機制尚不清楚。轉錄組分析是解析環(huán)境適應、發(fā)育調控和植物-病原體相互作用中基因表達和調控機制的有力工具。東北農(nóng)業(yè)大學許向陽老師課題組利用抗性和非抗性番茄材料，從生理學層面和轉錄組層面解析了Cf-10介導的C. fulvum抗性反應機制。

2.材料與方法
試驗材料：Ontario 792（帶有Cf-10）、Moneymaker（無C. fulvum抗性基因）兩種番茄株系。
試驗方法：
1）接種C. fulvum 0、5、9、12、16、21日，顯微鏡觀察，測定酶活性，用LC-MS測定激素水平；
2）接種C. fulvum 0、21日，各3個生物學重復，共12個樣本進行轉錄組測序，測序平臺為北京百邁客生物科技有限公司Illumina，PE150；
3）qRT-PCR驗證。

3.研究結果
1）番茄葉中C. fulvum的入侵過程
Ontario 792和Moneymaker葉片中C. fulvum的侵染過程如圖1所示。在Ontario 792葉片中，在9 dpi中出現(xiàn)少量的HR區(qū)域，在16 dpi 才開始顯著擴大，且沒有菌絲萌發(fā)。在Moneymaker中，菌絲萌發(fā)，壞死灶在9 ~ 16 dpi的葉片中持續(xù)增加，并覆蓋葉片表面。

圖1 顯微鏡觀察病原體侵染過程
注：A~E為Ontario 792，F(xiàn)~J為Moneymaker

2）抗氧化酶和過氧化物酶對C. fulvum感染的應答反應
接種后0、5、9、12、16和21 dpi，分別對番茄葉片中ROS的含量、CAT、SOD、POD的活性進行檢測，如圖2所示。從0到21 dpi，Ontario 792中ROS含量始終低于Moneymaker。在兩個株系中，從0到5 dpi CAT的活性增加，然后從5到21dpi緩慢降低。在Ontario 792中，從0到5 dpi SOD的活性增加，然后從5到12 dpi下降。相比之下，Moneymaker中，SOD活性剛開始是下降，然后從5到21 dpi呈增加趨勢。Ontario 792中，POD活性從0到21 dpi相對穩(wěn)定，但在Moneymaker中，大幅增加直到9 dpi，然后從9到21 dpi保持相對穩(wěn)定 。從0到16 dpi，Ontario 792中CAT和POD活性高于Moneymaker。這些結果說明Cf-10激活了番茄對C. fulvum感染的生理應答反應。

圖2 C. fulvum侵染后ROS含量和CAT、SOD、POD活性的變化

激素對C. fulvum感染的應答反應
3）如圖3所示， Ontario 792中，SA含量剛開始緩慢下降，然后緩慢上升直到16 dpi。Moneymaker中，SA含量在5 dpi下降至最低水平，然后逐漸增加直到12 dpi。Ontario 792中，從5 ~ 9 dpi JA含量迅速上升到峰值，然后從9到12dpi下降到原始水平，但Moneymaker中始終保持相對穩(wěn)定，表明JA可能參與激活對C. fulvum的防御系統(tǒng)。

圖3 C. fulvum侵染后SA和JA的變化

4）基因與生物途徑對C. fulvum感染的應答反應
4.1）差異表達基因及其功能與途徑分析
為了探討受C. fulvum感染的和未受感染的Ontario 792、Moneymaker中轉錄組的差異，進行了轉錄組測序。Cf-0 vs Cf-16、MM-0 vs Cf-0、MM-0 vs MM-16、MM-16 vs Cf-16分別有2242、329、1823和285個DEGs，表明Ontario 792攜帶的防御應答基因可能比Moneymaker多。Cf-0 vs Cf-16 和MM-16 vs Cf-16只有76個共有的DEGs，表明Ontario 792、Moneymaker中有不同的基因集的反應機制被C. fulvum激活。
對DEGs 進行GO和KEGG注釋及富集分析，GO注釋結果表明Cf-0 vs Cf-16的DEGs主要注釋在BP分類中的“氧化還原過程”、“光合作用”、“光捕獲”等，CC分類中的“細胞壁”、“葉綠體類囊體膜”等，MF類別中的“氧化還原酶活性”、“水解酶活性”等term中。對于MM-16 vs Cf-16的DEGs，只有“氧化還原過程”在CC類別中是顯著的，在CC類別中是“葉綠體”、“細胞核”和“線粒體”，在MF類中沒有顯著的term。因此，這些重要GO term的相關的基因可能在抗C. fulvum感染中具有重要作用。KEGG富集分析結果表明，Cf-0 vs Cf-16的DEGs在植物激素信號轉導、苯丙類生物合成、光合作用-天線和植物-病原互作通路中大量富集。在Cf-0 vs Cf-16和Cf-16 vs MM-16中分別有59和8個與植物激素信號轉導通路相關的DEGs。Ontario 792和Moneymaker的激素生物合成相關的DEGs表達模式不同，說明植物激素在調節(jié)C. fulvum的抗性反應方面起著關鍵作用。

圖4 DEGs功能注釋與富集分析

采用MapMan軟件對Cf-0 vs Cf-16的DEGs的調控通路進行了分析（圖5），其中大部分DEGs上調，且為TFs。上調的基因可分類到信號轉導、PR蛋白、TFs、激素ABA、SA、JA和乙烯，進一步證實了番茄中這些途徑在cf -10介導的c – fulvum感應和防御中起重要作用。TFs是基因表達的主要調控因子，在病原攻擊后的植物防御應答的基因轉錄重組中發(fā)揮重要作用。Cf-0 vs Cf-16中有192個TFs，可分為42個TF家族。其中，一些TFs與非生物或生物脅迫的應激反應有關。

圖5 利用MapMan進行DEGs調控通路分析

4.2） DEGs的qRTPCR驗證
選擇參與植物-病原體相互作用、植物激素信號轉導、抗氧化酶依賴性防御信號等重要途徑的Cf-0 vs Cf-16、MM-16 vs MM-16共有DEGs，且是TF的基因，進行qRTPCR驗證。結果表明，RNA-seq和qRTPCR結果高度相關(R2 = 0.72349)。

總結：
本研究從生理方面，分析兩種番茄株系在感染C. fulvum后活性氧(ROS)、保護酶和激素的應答反應，從轉錄組層面，探究兩種番茄株系在感染C. fulvum后基因表達和生物途徑的應答反應。結果表明，C. fulvum感染誘導激活POD、CAT和SOD的活性，降低ROS水平，JA在感染初期參與防御應答反應。感染后，表達量發(fā)生變化的DEGs大多與防御信號通路相關，包括氧化還原過程、氧化還原酶活性和植物激素信號轉導。因此，cf -10主要通過調控與氧化還原、氧化還原酶活性和植物激素信號轉導等相關的基因的表達，其中包括一些重要的TFs，調節(jié)激素JA、SA信號級聯(lián)通路、抗氧化酶防御信號系統(tǒng)等，來介導番茄對C. fulvum的防御應答反應。

參考文獻：
Guan Liu, Junfang Liu, Chunli Zhang, et al. Physiological and RNA-seq analyses provide insights into the responsemechanism of the Cf-10-mediated resistance to Cladosporium fulvum infection in tomato. [J]. Plant Molecular Biology.

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