蛋白組研究中的iTRAQ技術(shù)

一萬(wàn)年太久，只爭(zhēng)朝夕，就讓一個(gè)億隨風(fēng)去吧，新的一年我們不僅餃子要吃飽，文章也要發(fā)表，蛋白組文章來(lái)一波~

1.蛋白組研究簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)是生理活動(dòng)的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制。對(duì)細(xì)胞或組織的全蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)分析的蛋白質(zhì)組學(xué)，是目前發(fā)展迅速的組學(xué)研究之一，已被廣泛用于生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性狀改良、免疫互作、藥物作用機(jī)制、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)等的研究。
所謂“工欲善其事，必先利其器”，科學(xué)研究也一樣，下面就給大家介紹一下已被廣泛應(yīng)用到蛋白組研究中的iTRAQ技術(shù)。

2.iTRAQ技術(shù)介紹
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)是由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標(biāo)簽，通過(guò)特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量。

圖1 iTRAQ技術(shù)簡(jiǎn)介

iTRAQ試劑由三部分組成：報(bào)告基團(tuán)；質(zhì)量平衡基團(tuán)和肽反應(yīng)標(biāo)記試劑基團(tuán)，可形成4種或8種相對(duì)分子質(zhì)量均為145的等量異位標(biāo)簽。

圖2 iTRAQ試劑標(biāo)記肽段

iTRAQ試劑標(biāo)記酶解后的肽段，可與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記同重元素(isobaric)。在一級(jí)質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，報(bào)告基團(tuán)斷裂下來(lái)產(chǎn)生報(bào)告離子，根據(jù)報(bào)告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過(guò)軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。

3.iTRAQ文獻(xiàn)
據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，通過(guò)iTRAQ技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)研究，發(fā)表的文章已達(dá)到2500+，通過(guò)iTRAQ技術(shù)進(jìn)行蛋白組研究發(fā)表文章，接收率還是非常高的~下面iTRAQ文章簡(jiǎn)介來(lái)一波~

01 抗逆性狀改良
植物在遇到各種環(huán)境侵害(如高溫、低溫、干旱、高鹽、高滲透壓、臭氧及機(jī)械損傷等)時(shí)會(huì)發(fā)生應(yīng)激保護(hù)措施。這些脅迫可以引起大量的蛋白質(zhì)在種類和表達(dá)量上的變化,通過(guò)對(duì)耐旱能力不同的小麥品系進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以了解小麥對(duì)脅迫的適應(yīng)機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
小麥抗旱品種Opata，小麥耐旱品種Nesser，兩個(gè)品種。
取正常培養(yǎng)及ABA處理?xiàng)l件后的根，共4組。
測(cè)序策略：
iTRAQ（三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用三個(gè)iTRAQ4標(biāo)）、LC-MS/MS、qRT-PCR。
研究結(jié)果：
1、利用iTRAQ方法共鑒定出1656個(gè)蛋白，其中936個(gè)為顯著差異蛋白。
2、從差異分析結(jié)果中，篩選出抗旱能力不同的小麥中特有蛋白（同時(shí)對(duì)ABA處理有響應(yīng)）；通過(guò)qRT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
文章亮點(diǎn)：
除了對(duì)相同作物不同品系與處理?xiàng)l件進(jìn)行的蛋白組比較研究，本研究的小麥蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)采用多個(gè)不同的小麥數(shù)據(jù)庫(kù)，極大提升了蛋白鑒定數(shù)量。

02 動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育
豬肉的生長(zhǎng)速率和肉質(zhì)是其重要的兩個(gè)經(jīng)濟(jì)學(xué)指標(biāo)，由多種基因和生物學(xué)通路調(diào)控，通過(guò)蛋白組學(xué)研究可以充分了解動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)蛋白，為品質(zhì)改良打下基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
中國(guó)本土品種：藏豬（TP）、滇南小耳豬（DSP）。
西方引進(jìn)品種：約克豬（YY）和長(zhǎng)白豬（LL）的背最長(zhǎng)肌樣本。六月齡取樣，以尋找參與豬肌肉生長(zhǎng)和脂肪沉積的關(guān)鍵蛋白。
測(cè)序策略：
iTRAQ（兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用一個(gè)iTRAQ8標(biāo)）、LC-MS/MS、PRM分析技術(shù)。
研究結(jié)果：
作者應(yīng)用iTRAQ對(duì)四組樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出了4815個(gè)多肽，對(duì)應(yīng)969種蛋白。在這之中有288種為差異性表達(dá)蛋白（DEPs），其中169種蛋白在TP-DSP組上調(diào)，119種下調(diào)。
作者隨即對(duì)這些DEPs分別進(jìn)行了GO和KEGG分析，篩選出了28種與肌肉生長(zhǎng)相關(guān)和15種與脂肪沉積相關(guān)的蛋白。
文章亮點(diǎn)：
本文最后應(yīng)用PRM對(duì)iTRAQ的分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，由于此方法需要目標(biāo)蛋白有樣本中唯一的多肽作為標(biāo)記，因此只對(duì)其中的12種蛋白進(jìn)行了PRM分析，結(jié)果均與iTRAQ一致，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

03 免疫互作
玉米作為世界范圍內(nèi)主要作物,受昆蟲(chóng)攻擊造成巨大的生產(chǎn)損失。文章旨在研究玉米受食草昆蟲(chóng)攻擊的響應(yīng)機(jī)制，著重分析與機(jī)械損傷相比，食草昆蟲(chóng)的口腔分泌物對(duì)植物-昆蟲(chóng)之間互作所起的作用。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
W組：未處理的玉米葉片；W+W組：20 μL水處理V3期玉米機(jī)械損傷的葉片；
W+OS 組：20μL口腔分泌液處理V3期玉米機(jī)械損傷的葉片。
測(cè)序策略：
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（三個(gè)生物學(xué)重復(fù)）：W+W組和W+OS 組，處理1.5h、6h。
iTRAQ蛋白定量技術(shù)（三個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。
靶向代謝組：激素表達(dá)水平檢測(cè)，篩選測(cè)序時(shí)間點(diǎn)；非靶向代謝組。
研究結(jié)果：
4406個(gè)差異表達(dá)的基因中，4142個(gè)基因沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白表達(dá)，只有64個(gè)基因在蛋白水平上有明顯變化。差異表達(dá)的蛋白有294個(gè)，其中214個(gè)在轉(zhuǎn)錄水平上沒(méi)有顯著差異，推測(cè)這些蛋白很可能存在轉(zhuǎn)錄后修飾。
文章亮點(diǎn)：
文章利用多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)）技術(shù)聯(lián)合分析玉米受植食昆蟲(chóng)攻擊后的響應(yīng)機(jī)制，并構(gòu)建繪制了系統(tǒng)的調(diào)控模型。這些數(shù)據(jù)對(duì)玉米防御昆蟲(chóng)災(zāi)害的進(jìn)一步遺傳學(xué)研究搭建了很好的框架，也為抗昆蟲(chóng)災(zāi)害的玉米新品種的培育奠定了良好的基礎(chǔ)。

4.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白庫(kù)

廣大人民群眾喜聞樂(lè)見(jiàn)的餃子餡料，比如韭菜、茴香和大白菜等，至今還基本沒(méi)有進(jìn)行蛋白組研究。作為百合科植物，韭菜的基因組較大，至今都沒(méi)有其基因組信息發(fā)表出來(lái)，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息也很少，所以關(guān)于韭菜的基因檢測(cè)研究一直都是個(gè)空白。
類似韭菜這種研究結(jié)果比較少的物種，可以采用轉(zhuǎn)錄組+蛋白組的測(cè)序方式，用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)，后期進(jìn)行蛋白的定性及定量，對(duì)蛋白鑒定數(shù)量的提升也有很大助力。

參考文獻(xiàn)
[1]Wang Z, Peng S, Li Q, et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs[J]. Sci Rep, 2017, 7:46717.
[2]Alvarez S, Choudhury S R, Pandey S. Comparative Quantitative Proteomics Analysis of the ABA Response of Roots of Drought-Sensitive and Drought-Tolerant Wheat Varieties Identifies Proteomic Signatures of Drought Adaptability[J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(3):1688-701.
[3]Qi J, Sun G, Wang L, et al. Oral secretions from Mythimna separata insects specifically induce defense responses in maize as revealed by high-dimensional biological data[J]. Plant, 2016, 39(8):1749.

轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)部 小 張丨文案
吳戈宇 | 審核
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