12篇QTL定位相關(guān)的SCI文章“橫空出世”了～～～
在這里，小編必須要恭賀各位老師們?cè)谛履暌潦既〉昧恕伴_門紅！
來(lái)來(lái)來(lái)，咱往下看↓
（文末繼續(xù)有中標(biāo)的國(guó)自然標(biāo)書分享~）
本期，為大家解讀通過(guò)SLAF-BSA對(duì)小麥抗病性進(jìn)行基因定位的文章，一起來(lái)看一下長(zhǎng)江大學(xué)馬東方副教授和朱永興講師在《Scientific Reports》上發(fā)表的“利用SLAF-BSA快速鑒定小麥空間輻射突變體中抗條紋病基因”。
1.研究背景
普通小麥?zhǔn)侵饕募Z食作物之一，但由于小麥條銹病菌的侵害，使得小麥產(chǎn)量逐年降低，尤其是在西南和西北地區(qū)。條銹病抗性分為全生育期抗性（ASR，包括幼苗和成株）和成株抗性（APR），前者通常是單個(gè)主效基因控制的，是傾向于針對(duì)某一特定菌種而產(chǎn)生的抗性，而后者的抗性則不針對(duì)某一特定菌種且為數(shù)量遺傳，其保護(hù)水平通常是不完全的，并受生長(zhǎng)階段，溫度，濕度和接種量的影響。因此，定位這兩種小麥抗條銹病抗性基因是當(dāng)務(wù)之急。
2.材料與方法
01.材料
親本：銘賢169（Mingxian 169）×R39，銘賢169為感病栽培種；R39為抗性品種，是鄭麥9023（zhengmai 9023）突變體材料自交8代所形成
群體類型：F2群體
混池規(guī)模：45+45
其他材料：F1、BC1和鄭麥9023
02.實(shí)驗(yàn)處理
在可溫控的溫室內(nèi)，利用7個(gè)條銹病菌 (CYR29, CYR30, CYR31, CYR32, CYR33, Su11-4 和 Su11-11)的新鮮夏孢子對(duì)雙親、F1、BC1，F(xiàn)2和鄭麥9023的完全展開的第一片子葉進(jìn)行侵染。
幼苗試驗(yàn)處理：先在10°C的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)24h，然后移置溫室，在環(huán)境變化的條件下培養(yǎng)（循環(huán)方式：18°C下，光照16h；10°C下，黑暗8h）；
成株試驗(yàn)處理；將發(fā)芽幼苗在4℃冰箱中春化5周，然后移栽到盆中溫室生長(zhǎng)。
1個(gè)月后，孕穗期的親本和后代接種混合有滑石的夏孢子（urediniospore）并如上所述溫育，接種18-20d記錄侵染類型（IT），并按前人劃分標(biāo)準(zhǔn)分為0-4。IT 0至2+的認(rèn)為具有抗性，而IT3至4的則認(rèn)為是易感的。
收集種子測(cè)量千粒重（TSW）。每個(gè)栽培品種三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
03.技術(shù)手段
1）SLAF-seq+BSA：銘賢169、R39、感病混池和抗病混池（混池材料各45個(gè)），計(jì)算方法：SNP-index和ED；
2）SSR-遺傳圖譜：銘賢169、R39、高感病混池和高抗病混池（混池材料各10個(gè)，來(lái)自上述測(cè)過(guò)序的材料）（互為驗(yàn)證）；
3）qRT-PCR：每次實(shí)驗(yàn)做了三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)兩次技術(shù)性重復(fù)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01.小麥突變體R39具有成株抗性
在抗性鑒定中發(fā)現(xiàn)，其在幼苗期對(duì)7種病菌均呈現(xiàn)感病，而成株期均呈現(xiàn)抗病（圖1a）；而鄭麥9023和銘賢169全生育期均為感病。此外，R39的千粒重顯著高于鄭麥9023和銘賢169，這表明在條銹病發(fā)病條件下，R39的籽粒產(chǎn)量更高，種子質(zhì)量更好（圖1b-d）。
圖1 抗性和產(chǎn)量評(píng)價(jià)
02.針對(duì)CYR33菌種，R39 的APR由一個(gè)隱性基因控制
如表1，F(xiàn)2群體分離比是3:1，所以CYR33的R39 的APR由一個(gè)隱性基因控制。這個(gè)抗病基因命名為YrR39。在R39、抗性F2和抗性BC1材料中一個(gè)顯著特征是葉斑點(diǎn)。而且上述兩個(gè)特征在未接種的群體內(nèi)也是一樣的。
表1 親本及分離群體抗病和感病頻率統(tǒng)計(jì)
03.SLAF-seq+BSA的分析結(jié)果
利用SNP-index和ED兩種算法，將抗病基因YrR39定位在4B染色體上17.39 Mb的區(qū)域內(nèi)。（這里就不細(xì)說(shuō)了，直接上圖）
圖2 BSA分析的兩種方法的結(jié)果
04.利用SSR標(biāo)記驗(yàn)證目標(biāo)區(qū)域
4B染色體上有83對(duì)SSR是有多態(tài)性的，但是其中只有8對(duì)能清楚的區(qū)分雙親及兩個(gè)混池。利用其對(duì)462個(gè)F2個(gè)體進(jìn)行基因分型并構(gòu)建遺傳圖譜，將YrR39定位于染色體4BL 的2.6cM的區(qū)間內(nèi)，其側(cè)翼標(biāo)記為Xwmc495和Xwmc48（如圖3）。這與BSA分析結(jié)果一致，也驗(yàn)證了SLAF-seq檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
圖3? 染色體4BL的連鎖圖譜
05.條銹菌感染對(duì)候選基因表達(dá)的影響
目標(biāo)區(qū)域包含126個(gè)基因（表3），通過(guò)功能注釋，找到21個(gè)與條銹病抗性相關(guān)的基因，擬定為候選基因，并進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，在病菌接種后12、24、48和96h，只有候選基因Traes_4BS_C868349E1（注釋為F-box / LRR-重復(fù)蛋白）在R39中顯示出比在銘賢169中更高的表達(dá)水平（圖4）。 這表明其可能參與了R39對(duì)條銹病的抗性。
表3 關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)結(jié)果
圖4? 21個(gè)候選基因的qRT-PCR結(jié)果
借鑒之處
1. 表型鑒定的方法是基于前人的方法，且將突變的原始材料鄭麥9023作為對(duì)照，增加結(jié)果的可靠性；
2. 利用SSR圖譜和測(cè)序結(jié)果互相驗(yàn)證，確保結(jié)果可靠；
3. 找到區(qū)間，然后看功能注釋找候選基因，對(duì)候選基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證（也可用RNA-seq來(lái)驗(yàn)證）
4. 研究斑點(diǎn)性狀這個(gè)病癥與抗性的關(guān)系，這一點(diǎn)來(lái)源于細(xì)心的觀察和不斷的思考（思考什么呢？你懂得~~）；
5. 作者仍在繼續(xù)驗(yàn)證這個(gè)基因（科研的態(tài)度）。正所謂真金不怕火煉，前面所提幾種方法均可對(duì)其驗(yàn)證，以增加可靠度。
遺傳群體事業(yè)部 小猴子丨文案
許語(yǔ)輝 | 審核
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