【成功案例】轉(zhuǎn)錄組和代謝組解析風(fēng)信子變色分子機(jī)制

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英文題目：Transcriptome sequencing and metabolite analysis reveals the role of delphinidin metabolism in flower colour in grape hyacinth
中文題目：轉(zhuǎn)錄組和代謝組解析風(fēng)信子變色分子機(jī)制
發(fā)表雜志：Journal of Experimental Botany
影響因子：5.830

研究背景

葡萄風(fēng)信子（Muscari）是一種重要的觀賞性球根植物，具有獨(dú)特藍(lán)色、花形和甜香。天然突變種白色風(fēng)信子為探究某些潛在生化特征，特別是顏色相關(guān)的復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)研究提供了機(jī)會。據(jù)報(bào)道，花青素是風(fēng)信子花色的主要色素。藍(lán)色花主要由飛燕草色素（Del）決定，紅色花由花青色素（Cy）決定?；ㄇ嗨厥侵参锟茖W(xué)中研究最多和最了解的化合物之一，然而，在不同植物中調(diào)控花青素分解代謝的分子機(jī)制還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有定論。
通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組技術(shù)，不僅可以對轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，還可以對代謝產(chǎn)物進(jìn)行比較分析，從而深入解析決定表型的分子調(diào)控機(jī)制。本研究首次使用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，揭示與風(fēng)信子花色素沉著相關(guān)的主要代謝途徑，并且挖掘針對植物中色素沉積相關(guān)的關(guān)鍵基因。

材料與方法

1.轉(zhuǎn)錄組測序：白色和藍(lán)色風(fēng)信子花苞分別測序；
測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司Illumina HiSeq 2000。
2.代謝組檢測：白色和藍(lán)色風(fēng)信子分別采用HPLC檢測花色素和其他類黃酮物質(zhì)，每個(gè)樣品三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
3.qRT-PCR：對花色相關(guān)基因驗(yàn)證，每個(gè)樣品兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，三個(gè)技術(shù)重復(fù)。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.風(fēng)信子主要色素化合物定量分析
采用HPLC分別對藍(lán)色和白色風(fēng)信子中花青色素定量分析，結(jié)果顯示藍(lán)色風(fēng)信子中含有飛燕草素（Del）和花青素（Cy）兩種花青色素，白色風(fēng)信子中沒有檢測到花青色素或其衍生物。 進(jìn)一步研究表明，白色風(fēng)信子中楊梅黃酮（myricetin ）和兒茶素（catechin ）的存在，表明花青素合成通路（ABP）下游作用的基因發(fā)生改變，如dihydroflavonol 4-reductase (DFR)，anthocyanidin synthase (ANS)，或anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase（UFGT），導(dǎo)致花青素合成通路受阻。

圖1 藍(lán)色和白色花中花青素代謝過程通路

2.藍(lán)花風(fēng)信子花色相關(guān)基因檢測
藍(lán)色和白色風(fēng)信子分別建庫測序，分別得到2,031M和2,772M原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)經(jīng)去冗余后組裝后得到89,926條uni-transcripts，平均長度為633bp。通過KEGG通路注釋，共有143個(gè)uni-transcripts注釋到色素相關(guān)的三個(gè)代謝通路，類黃酮生物合成，花青素生物合成，黃酮和黃酮醇生物合成途徑。

表1 藍(lán)色風(fēng)信子與花色素有關(guān)的候選基因

3.藍(lán)色和白色風(fēng)信子中與花青素相關(guān)的差異基因
通過將藍(lán)色和白色風(fēng)信子花青素顏色代謝相關(guān)關(guān)鍵基因比較分析，顯示出了與一般研究相反的結(jié)果，即在白色風(fēng)信子花中，大部分花青素合成相關(guān)的uni-transcripts表達(dá)豐度高于在藍(lán)色花中的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在白色花瓣提取物中檢測到大量的類黃酮化合物，其中許多與花青素共享相同的中間體或酶。這可能是花青素含量與葡萄風(fēng)信子花色苷生物合成基因表達(dá)量不相關(guān)的主要原因。最后，選擇花色相關(guān)基因qRT-PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 風(fēng)信子花色發(fā)育相關(guān)的生理和代謝相關(guān)的數(shù)據(jù)示意圖

4.白色風(fēng)信子色澤形成的關(guān)鍵基因
在藍(lán)色風(fēng)信子中檢測到與Del合成相關(guān)的部分同源序列的表達(dá)上調(diào)，在某些情況下，高出> 1000倍。結(jié)合HPLC分析結(jié)果，DFR可能是白色葡萄風(fēng)信子中藍(lán)色色素沉積（Del）消失的靶基因。另外，F(xiàn)LS和DFR在共同的二氫楊梅素底物之間的強(qiáng)烈競爭，可能部分地阻斷Del的合成并引起其他類黃酮化合物，如楊梅素的產(chǎn)生，由此進(jìn)一步消除白色風(fēng)信子中藍(lán)色色素沉積。

圖3 白色風(fēng)信子花朵中Del消除過程的模型

?5.白色風(fēng)信子中紅色Cy消失的原因
白色風(fēng)信子花瓣中兒茶素（catechin ）和表兒茶素（epicatechin ）的存在，表明紅色Cy一定存在于白色花中，即使只是很短的時(shí)間或很少的量，暗示著Cy色素丟失的復(fù)雜代謝機(jī)制。Cy合成上游反應(yīng)中的通路的受阻以及下游反應(yīng)中的多重分支變化過程，最終導(dǎo)致白花紅色色素的消失。

圖4 白色風(fēng)信子花朵中Cy消除過程模型

小編寄語

1.本篇文章結(jié)合已發(fā)表的文章，采用靶向代謝組的技術(shù)，分析白色和藍(lán)色風(fēng)信子中與花青素合成相關(guān)差異代謝物，同時(shí)通過轉(zhuǎn)錄組解析花色素合成相關(guān)差異基因變化，最后轉(zhuǎn)錄組和代謝組揭示了白色風(fēng)信子褪色分子機(jī)制。
2.本篇文章采用HPLC平臺對已知代謝物進(jìn)行定性和定量，隨著代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)在更多的采用色譜和質(zhì)譜（LC-MS和GC-MS）技術(shù)聯(lián)用能夠更全面和更準(zhǔn)確定性和定量代謝物，同時(shí)結(jié)合生物信息分析技術(shù)，能夠更高效的挖掘與表型相關(guān)的差異代謝物，將代謝物變化以精美的圖形呈現(xiàn)。
3.在系統(tǒng)基因組時(shí)代，多組學(xué)分析已經(jīng)成為大勢所趨，研究同一物種不同表型，采用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，先通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)找出差異基因，并對差異基因功能注釋分析，再通過非靶向代謝組技術(shù)全掃差異代謝物，將差異基因和差異代謝物關(guān)聯(lián)分析，輔助挖掘與表型差異相關(guān)的關(guān)鍵基因，最后，只需簡單定量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即可輕松實(shí)現(xiàn)文章快速發(fā)表。

參考文獻(xiàn)

Lou Q., Liu Y., Qi Y.,et al. Transcriptome sequencing and metabolite analysis reveals the role of delphinidin metabolism in flower colour in grape hyacinth.Journal of Experimental Botany. 2014, 65(12), 3157–3164 doi:10.1093/jxb/eru168.

轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)部 蘇靜靜 | 文案
吳戈宇 | 審核
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