作為國內(nèi)第三代測序領(lǐng)域的領(lǐng)航者，百邁客遵循ISO 15189國際質(zhì)量體系要求建成了分子遺傳實(shí)驗(yàn)室，并率先引進(jìn)了PacBio RSII和PacBio Sequel第三代測序儀。截至2017年8月，百邁客已經(jīng)完成了多個(gè)物種的全長轉(zhuǎn)錄組測序，主要包括花卉、作物、蔬果、水產(chǎn)等?；诙嗄甑捻?xiàng)目積累，我們擁有豐富的樣本處理與數(shù)據(jù)分析的經(jīng)驗(yàn)，助力文章的快速發(fā)表。今天和大家分享一篇公司的三代項(xiàng)目文章。
研究背景
甘薯是許多發(fā)展中國家重要的作物之一，也是重要的能量來源。甘薯是同源六倍體植物，基因組大小約3-4G，目前還沒有高質(zhì)量的參考基因組。甘薯采用異花授粉的繁殖方式，自交不孕，導(dǎo)致基因組的雜合度高，目前還沒有關(guān)于甘薯正向遺傳學(xué)研究的報(bào)道。幾乎所有關(guān)于甘薯轉(zhuǎn)錄本的研究都是采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法，沒有獲得大規(guī)模的全長cDNA序列，因此阻礙了甘薯功能基因組學(xué)和分子育種研究的進(jìn)展。長期以來，人們一直認(rèn)為甘薯有可能由二倍體祖先野生甘薯（I. trifida）進(jìn)化而來，但是沒有確鑿的證據(jù)。
研究目的
通過2+3聯(lián)合測序的方法獲得甘薯和野生甘薯的全長轉(zhuǎn)錄本，揭示二者的進(jìn)化關(guān)系。
材料方法
實(shí)驗(yàn)材料
甘薯和野生甘薯，不同組織（幼葉、成熟葉、莖尖、莖稈、須根、起始塊根、膨大塊根和成熟塊根）分別等重量混合，提取RNA用于三代測序；同樣的材料用于二代測序。
測序方法及數(shù)據(jù)量
百邁客Pacbio RSII：構(gòu)建1-2k、2-3k、>3k的3個(gè)文庫，每個(gè)文庫分別測1個(gè)、2個(gè)、1個(gè)cell，共8個(gè)cell。
百邁客Illumina HiSeq 2500：甘薯和野生甘薯各測了17G和11G數(shù)據(jù)。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
5.1 全長轉(zhuǎn)錄本的統(tǒng)計(jì)及結(jié)構(gòu)注釋分析
統(tǒng)計(jì)三代的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：甘薯得到220,035 個(gè)ROI（reads of insert），其中全長非嵌合轉(zhuǎn)錄本（Full-Length Non-Chimeric, FLNC）占49.9％，非全長轉(zhuǎn)錄本（Non-Full-Length, NFL）占46.6％；野生甘薯得到195,188 個(gè)ROI，其中FLNC 和NFL 分別占52.1％和43.9％。對三代的數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正（自我糾錯(cuò)+二代數(shù)據(jù)矯正），甘薯和野生甘薯分別獲得了53,861和51,184個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本。此外，甘薯和野生甘薯分別預(yù)測到了104,540 和94,174 個(gè)ORF，全長轉(zhuǎn)錄本（同時(shí)含有5’-UTR，CDS和3’-UTR）分別有34,963和33,637個(gè)。甘薯和野生甘薯分別鑒定到了 25,315和 27,090 個(gè)SSR，以及471 和531 個(gè)lncRNA。
Figure 1. 對三代測序的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)和結(jié)構(gòu)注釋
5.2 甘薯、野生甘薯與其它植物的CDS比較分析
為了評估甘薯、野生甘薯的轉(zhuǎn)錄本和其他植物基因的相似性，我們比較了甘薯、野生甘薯與其他植物的開源CDS數(shù)據(jù)庫，包括紅苔藤、野生甘薯、牽?；?、煙草、馬鈴薯、大豆、擬南芥和水稻。結(jié)果表明甘薯和野生甘薯大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本都是同源的，說明這兩個(gè)物種擁有一個(gè)大致相同的基因庫。觀察高比例的轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)，盡管這些物種中的大量基因在進(jìn)化過程中存在著巨大的差異，但仍然共有一些短的motif，說明這些基因在進(jìn)化上顯示出高度的保守性。
Figure 2. 比較甘薯、野生甘薯和其他植物的轉(zhuǎn)錄本
5.3 全長轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)分析
三代測序得到的全長cDNA對于研究基因的結(jié)構(gòu)非常有用，例如分析外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。我們隨機(jī)挑選了50個(gè)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些基因含有的外顯子數(shù)目在甘薯、野生甘薯和擬南芥三個(gè)植物中的分布是相似的。
Figure 3. 分析甘薯、野生甘薯和擬南芥的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)
5.4 甘薯和野生型甘薯的Ka/Ks分析
人們普遍認(rèn)為二倍體野生甘薯是六倍體作物甘薯的祖先，為了尋找參與甘薯進(jìn)化的候選基因，我們研究了甘薯和野生甘薯的基因選擇模式。首先比較了二者的完整轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)集，去除有多種同源性可能的那些轉(zhuǎn)錄本，確定了1269個(gè)假定的甘薯和野生甘薯之間的同源基因?qū)?。隨后，計(jì)算了每個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks比值，大多數(shù)基因?qū)Φ腒a/Ks比值都小于1，只有56個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks比值大于1，表明在甘薯的進(jìn)化或馴化過程中，大多數(shù)基因都是受到純化選擇的。而受到正向選擇的這些基因?qū)⒆鳛楹罄m(xù)研究的重點(diǎn)。
Figure 4. 分析甘薯和野生甘薯同源基因?qū)Φ腒a/Ks比值
創(chuàng)新點(diǎn)
1，對于無參或者參考基因組不好的物種，全長轉(zhuǎn)錄組可以獲得轉(zhuǎn)錄本全長序列，完善基因組注釋的信息。
2，通過全長比較轉(zhuǎn)錄組分析研究近源物種間的進(jìn)化關(guān)系。
參考文獻(xiàn)：
Generation and comparative analysis of full-length transcriptomes in sweetpotato and its putative wild ancestor I. trifida（bioRxiv在線發(fā)表，2017）
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