一看就懂！單細(xì)胞組學(xué)測序文章經(jīng)典分析思路，碼住收藏

2024年5月，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院在國際學(xué)術(shù)期刊Aging發(fā)表一項重要研究成果，題為：Single-cell BCR and transcriptome analysis reveals peripheral immune signatures in patients with thyroid-associated ophthalmopathy。使用單細(xì)胞RNA測序 (scRNA-seq)、scBCR-seq來剖析甲狀腺相關(guān)眼病患者外周免疫特征。

文章標(biāo)題：Single-cell BCR and transcriptome analysis reveals peripheral immune signatures in patients with thyroid-associated ophthalmopathy

期刊名稱：Aging.

合作單位：寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院

研究部位：眼

研究方法：scRNA-seq、scBCR-seq、流式細(xì)胞術(shù)

百邁客生物為該研究提供了單細(xì)胞測序服務(wù)。

 

研究背景

甲狀腺相關(guān)性眼病（Thyroid-associated Ophthalmopathy， TAO）是一種眼眶特異性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致毀容，并可能導(dǎo)致失明。目前，TAO的病因尚不清楚。TAO可與甲狀腺功能亢進癥、甲減癥合并使用，甲狀腺功能正常的患者數(shù)量逐年增加。它是一種器官特異性自身免疫性疾病，與甲狀腺功能有關(guān)，相對獨立。具有特征性眼部體征的TAO的常見癥狀是眼瞼回縮，伴或不伴眼突出，占所有 TAO的70-80%。它是Graves病（Graves’s disease，GD）的主要甲狀腺外表現(xiàn)，約20%-50%的GD患者受累。由于對其潛在免疫畸變的了解有限，因此開發(fā)有效的治療方法受到限制。

實驗材料

采用scRNA-seq和單細(xì)胞BCR測序 (scBCR-seq) 技術(shù)來研究具有活性TAO、不活性TAO和NC的個體之間細(xì)胞組成和BCR庫的變化。

1、scRNA-seq、scBCR-seq

使用來自6名TAO患者和3名NC的血液樣本進行scRNA-seq和scBCR-seq。

2、流式細(xì)胞術(shù)

15名非活動性TAO患者、7名活動性TAO患者和10名NC用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

研究結(jié)果

1.TAO患者外周免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜

為了了解疾病不同階段單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的異質(zhì)性，該研究根據(jù)CAS標(biāo)準(zhǔn)將TAO患者分為兩組：眼眶炎癥明顯的為活動組，臨床癥狀輕微的為非活動組。從每位受試者的全血中分離出PBMC以供進一步研究。

該研究使用10x Genomics Chromium平臺對總共9個樣本進行了scRNA-seq。經(jīng)過初步質(zhì)量控制后，總共獲得了93,007個PBMC用于后續(xù)分析，其中包括來自活性TAO的23,051個細(xì)胞、來自非活性TAO的34797個細(xì)胞和來自正常對照 (NC) 的35,159個細(xì)胞?；趫D的聚類分析確定了17個不同的聚類。在手動確認(rèn)細(xì)胞類型注釋后，該研究成功將簇分為五種主要的PBMC細(xì)胞類型。其中包括各種CD4+ T細(xì)胞群 (CD4+)、NK (CD56+)、CD8+T細(xì)胞 (CD8A+)、B細(xì)胞 (CD19+) 和骨髓細(xì)胞 (CD11b+)（圖1A，1B）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析驗證了scRNA-seq鑒定的這五種細(xì)胞類型的存在（圖1C）。值得注意的是，17個細(xì)胞簇中的12個 (70.6%) 包含來自多個單獨樣本的至少100個細(xì)胞，每個簇內(nèi)平均有9個單獨樣本。

接下來，該研究試圖根據(jù)疾病階段檢查這些人群的患病率變化。作者計算了通過 scRNA分析識別的每個簇相對于每個患者樣本的簇總數(shù)的百分比（圖1D）。研究結(jié)果顯示，患者的免疫特征存在顯著差異，活性TAO顯示顯著的B細(xì)胞浸潤 (p=0.047) 和骨髓細(xì)胞浸潤 (p=0.008) 。相比之下，NK細(xì)胞主要在非活性TAO (p=0.022) 和 NC (p=0.059) 中觀察到。盡管差異未達到統(tǒng)計學(xué)顯著性，但非活性TAO和NC樣本均顯示出CD4+T細(xì)胞的富集。CD8+T細(xì)胞的比例在這些樣本組中表現(xiàn)出最小的變化。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了活躍TAO個體中PBMC組成的變化，強調(diào)了深入了解細(xì)胞亞型多樣性和與疾病階段相關(guān)的狀態(tài)的重要性。

2.調(diào)節(jié)性B細(xì)胞參與TAO期間的免疫調(diào)節(jié)

為了全面了解B細(xì)胞的異質(zhì)性及其在TAO中的作用，該研究基于RNA-seq數(shù)據(jù)進行了進一步分析，以確定其不同的亞群。使用基于圖的聚類，該研究確定了五個亞群，總共包含9493個B 細(xì)胞（圖2A）。此外，該研究徹底評估了與B細(xì)胞譜系相關(guān)的一組綜合基因的表達，以更深入地了解它們的獨特特征。濾泡B細(xì)胞的特征是表達IGHD(IgD)和CD23（也稱為FCER2）。邊緣區(qū)B群體表現(xiàn)出JCHAIN(IgM) 和CD21的高表達。Bregs根據(jù)CD1d、CD5、CD19、CD24、CD38和CD27的表達進行鑒定。此外，生發(fā)中心B細(xì)胞被認(rèn)為是顯示高水平CD20 (MS4A1)、CD38?和FCRL3的簇。最后，少量B細(xì)胞被鑒定為多淋巴祖細(xì)胞，表達CD45RA (PTPRC)、CD34和CD10(MME)（圖2B）。每個B細(xì)胞亞群的前10個不同表達基因 (DEG) 為該研究的注釋提供了額外的證據(jù)，并支持每個 B 細(xì)胞亞群的獨特身份和功能特征。

隨后檢查了疾病不同階段每個樣本中的B細(xì)胞組成。雖然三組的Bregs相對比例沒有顯著差異，但與非活動TAO組和正常對照組相比，活動TAO中的Bregs比例較低（p=0.078和p=0.065）（圖2D）。盡管觀察到的差異未達到統(tǒng)計顯著性，但這一結(jié)果表明了數(shù)據(jù)的潛在趨勢。為了驗證這些結(jié)果，該研究進行了流式細(xì)胞術(shù)分析，并使用CD19+IL-10+作為識別Bregs細(xì)胞群的標(biāo)記。IL-10由于其抑制促炎癥反應(yīng)的能力而被廣泛認(rèn)為是Breg的標(biāo)志。該分析證實，與非活動TAO和NC組相比，活動TAO中的Breg頻率降低（圖2E）。

進行軌跡分析以闡明不同B細(xì)胞亞群之間的動態(tài)關(guān)系。分析發(fā)現(xiàn)了3個分支點和5 個不同的狀態(tài)。狀態(tài)1的特征是邊緣區(qū)B細(xì)胞和FCRL3高GC B細(xì)胞同時分布。狀態(tài) 2由一小部分濾泡B細(xì)胞組成。狀態(tài)3主要由濾泡B細(xì)胞組成。狀態(tài)4和狀態(tài)5主要由 Breg組成。此外，所有狀態(tài)都表現(xiàn)出彌散的多淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞（圖2F）。與之前的發(fā)現(xiàn)一致，該研究觀察到活性TAO中處于狀態(tài)4和狀態(tài)5的Bregs細(xì)胞密度降低。根據(jù)SCENIC分析，發(fā)現(xiàn)一組受不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的獨特基因在Bregs中特異性表達，而在其他細(xì)胞類型中幾乎不存在（圖2G）。在Bregs中，受RORA、CEBPD、PRDM1、FOSL2和EOMES調(diào)控的基因顯示出明顯更高的表達水平。

GO富集分析顯示，Bregs表現(xiàn)出與免疫調(diào)節(jié)（AIF1、CSK、HLA-DRB5、CYBA）、細(xì)胞周期進程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡相關(guān)的上調(diào)基因（ARPC1B、CORO1A、YWHAB），（RHOA，CLIC1，S100A6，NME2）（圖2H，2I）。值得注意的是，在活躍的TAO中，Bregs上調(diào)的基因在炎癥相關(guān)的GO術(shù)語和細(xì)胞過程相關(guān)的GO術(shù)語中豐富。這些發(fā)現(xiàn)強烈表明Bregs可能在TAO過程中調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。根據(jù)CellPhoneDB分析，Bregs表現(xiàn)出與骨髓細(xì)胞的高頻率通信（圖2J）。這一發(fā)現(xiàn)表明Breg和骨髓細(xì)胞可能在TAO期間參與協(xié)調(diào)的免疫調(diào)節(jié)過程。

3.scBCR-seq分析發(fā)現(xiàn)活性TAO中BCR多樣性顯著增加

為了全面分析B細(xì)胞群中的基因表達和BCR多樣性，該研究對scRNA-seq分析中使用的PBMC樣本進行了scBCR-seq。在活性TAO中，前10個克隆型的比例（0.17%）與非活性組（0.37%，p=0.010）和NC組（0.41%，p=9.31E-05）（圖3A）。然而，對互補決定區(qū)3 (CDR3) 長度的分析沒有顯示任何明顯的變化（圖3B）。當(dāng)檢查CDR3的多樣性時，通過Chao1指數(shù)量化，與NC組 (p=0.016) 和非活動TAO組 (p=0.002) (圖3C)。Breg細(xì)胞中也出現(xiàn)了類似的趨勢（圖 3D），與NC組相比顯著增加（p=0.011），但活性TAO之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異組和NC組 (p=0.213)。這些發(fā)現(xiàn)表明，雖然活性TAO中前10個克隆型的頻率降低，但在這種情況下CDR3序列的多樣性增加，這可能對免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有影響，并有助于活性TAO的發(fā)病機制。

4.活性TAO中骨髓細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變

為了評估骨髓細(xì)胞在TAO中的參與情況，該研究鑒定了骨髓細(xì)胞的主要亞型，并檢查了它們在活性TAO中的配置。分析顯示了五種不同的骨髓細(xì)胞群，即單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞 (DC)、單核細(xì)胞衍生的DC和紅細(xì)胞（圖4A ）。這些細(xì)胞類型的鑒定基于差異基因表達和對已建立的譜系標(biāo)記的檢查（圖4B）。活性TAO 和非活性TAO之間的比較揭示了單核細(xì)胞和DC比例的顯著差異。與非活動TAO組相比，活動TAO患者的單核細(xì)胞比例顯著較高 (p=0.006)，而活動TAO中DC的比例顯著較低 (p= 0.003) (圖4C)。這些發(fā)現(xiàn)表明，單核細(xì)胞水平增加和DC數(shù)量減少可能是TAO患者活動性疾病狀態(tài)的特征。

5.DCs可能參與TAO活躍期間的炎癥過程

DC被細(xì)分為三個不同的子簇。Cluster 0被指定為cDC1s，其特征是高表達CDKN1C、FCGR3A、SMIM25、IFITM3、LST1和MS4A7，以及CD1C和 CD141的低表達。簇1和簇2被鑒定為cDC2，其炎癥基因的表達水平升高，例如 CD14、S100A8、GNLY、NKG7 、IL32和S100A12（圖5A、5B）。cDC1s的比例在活性TAO中顯著較高，而cDC2s在非活性TAO和NC中更為普遍（圖 5C）。鑒于cDC1和cDC2在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮不同的作用- cDC1專門誘導(dǎo)Th2反應(yīng)，而cDC2亞群表現(xiàn)出更強大的誘導(dǎo)Th1反應(yīng)的能力[42]，該研究進一步檢查了它們的基因表達譜。

關(guān)于cDC1，與MHC II抗原呈遞（HLA-DRB5、IFI30）、免疫激活（NAPSB）以及發(fā)育和神經(jīng)遺傳相關(guān)的基因與NC相比，疾病 (NBPF14) 在活性TAO中高度表達（圖5D、5E）。對于cDC2，與NC相比，在活性TAO中觀察到更高水平的 HLA-DRB5和FCN1（圖5D，5E）。富集分析表明，對于兩種DC，活性TAO中上調(diào)的基因主要與炎癥、免疫激活途徑和補體激活途徑相關(guān)的各種過程相關(guān)（圖 5F）。這些結(jié)果表明，在活躍的TAO中，DC的活化可能受到損害，并且在此活躍階段觀察到的炎癥可能與這些細(xì)胞密切相關(guān)。

6.單核細(xì)胞通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生在活性TAO中發(fā)揮作用

作者的聚類分析成功地從總共 12,959 個單核細(xì)胞中識別出三個不同的亞群。第一個簇的特征是經(jīng)典單核細(xì)胞 (CMO)，其表現(xiàn)出高表達水平的CD14、S100A8 和 S100A9。第二個簇被鑒定為非經(jīng)典單核細(xì)胞 (NMO)，其特征是高表達FCGR3A（也稱為 CD16）。第三簇被識別為中間單核細(xì)胞 (IMO)，CD14和FCGR3A均高表達（圖6A、6B）。為了驗證這些單核細(xì)胞亞簇，進行了流式細(xì)胞術(shù)分析，確認(rèn) CMO為CD14++CD16-，NMO為CD14+CD16++，IMO為CD14++CD16+（圖6C）。軌跡推斷分析表明，單核細(xì)胞遵循從CMO開始并向NMO和IMO狀態(tài)分支的發(fā)育軌跡（圖6B）。這些對TAO期間單核細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)變化的觀察表明它們在該疾病中的潛在作用。

7.TAO中Breg細(xì)胞和骨髓細(xì)胞之間的串?dāng)_

進一步檢查了活躍TAO背景下Breg、DC和單核細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用。該分析總共確定了1,352對重要的相互作用。值得注意的是，Bregs被發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出最多數(shù)量的配體，而cDC1亞簇則表現(xiàn)出最多數(shù)量的受體。值得注意的是，與非活性TAO 和正常對照組(NC)相比，Bregs在活性TAO中顯示出配體數(shù)量增加（圖7A）。

該研究對與炎癥和免疫激活相關(guān)的相應(yīng)受體和配體的表達模式進行了詳細(xì)分析。與非活動性TAO組和正常對照(NC)組相比，活動性TAO患者中Breg與cDC1、cDC2、IMO、NMO或CMO之間的CD22-PTPRC相互作用明顯更強（圖7B）。此外，該研究觀察到活性TAO中存在強大的抑制相互作用，例如Bregs和cDC1、cDC2或IMO之間的BTLA-TNFRSF14。這一發(fā)現(xiàn)表明，在TAO活躍的情況下，Bregs可能發(fā)揮更大的免疫抑制作用（圖7B）。

通過檢查在免疫抑制和炎癥過程中具有潛在作用的基因的表達水平，研究發(fā)現(xiàn)活躍 TAO期間Breg中的CD22、PTPRC、BTLA和TNFRSF14增高。此外，與非活性TAO和正常對照(NC)組相比，活性TAO中的Breg、DC和單核細(xì)胞中BTLA和 TNFRSF14的表達水平總體增加（圖 7C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，在活躍的TAO過程中，Breg、DC和單核細(xì)胞之間存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)相互作用，這可能有助于在疾病中觀察到的炎癥和免疫反應(yīng)。

研究總結(jié)

該研究強調(diào)了具有活性TAO、非活性TAO和NC的個體中B細(xì)胞、DC和單核細(xì)胞的比例和轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)為了解活躍TAO期間外周免疫環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤的變化提供了寶貴的見解。

值得注意的是，該研究發(fā)現(xiàn)了兩個配體-受體對CD22-PTPRC和BTLA-TNFRSF14的潛在抑制作用，這可能有助于減少Bregs 并削弱活性TAO中炎癥的抑制作用。這些潛在的致病細(xì)胞和分子可能是TAO炎癥變化的原因，因此可能被確定為該疾病的新治療靶點。

此外，該研究描述了TAO中BCR庫的免疫特征，揭示了活躍TAO期間BCR多樣性的顯著增加。該研究揭示了活性TAO中觀察到的炎癥反應(yīng)的分子和細(xì)胞基礎(chǔ)。通過更好地了解這種情況下的免疫失調(diào)，該研究為未來開發(fā)更有效的免疫治療策略奠定了基礎(chǔ)。隨著對潛在機制的進一步驗證和探索，這些發(fā)現(xiàn)有可能為TAO患者的靶向和個性化治療做出重大貢獻。