DNA 項目樣品準備、儲存及運輸指南

前言

1. 適用范圍

本指南介紹百邁客 DNA 類組織樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細閱讀。

2. 聲明

對于危害程度為第一、二類的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織 樣。對于危害程度為三、四類的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過銷售或運營與醫(yī)學 實驗平臺負責人溝通，確認無高致病和傳染性且能進行后續(xù)實驗后再安排樣品寄送。危害 程度的判定標準具體參見《人間傳染的病原微生物名錄》 。

3. 提取風險提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境 等因素息息相關(guān)，故無法完全保證提取質(zhì)量，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障 獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請老師務必按照以下指導原則準備樣本。

樣本準備前注意事項

1. 取樣的代表性

所采集的樣本應該通過嚴格的細胞學、組織學、病理學等相關(guān)鑒定，因為這關(guān)系到實 驗最終結(jié)果是否具有科學意義，所以客戶須根據(jù)實驗目的設計相關(guān)科學取樣方案和取樣步 驟。

2. 取樣的準確性

正常組織樣本中不能含有病變組織，而病理組織樣本中也不可以夾帶有正常組織。在 條件允許的前提下，爭取做到實驗組與對照組的樣本在取材時間、部位、 處理條件等方面 盡可能保持一致，否則可能會影響實驗結(jié)果的重復性和可信度。 代表性樣本的各種特征數(shù) 據(jù)必須被準確記錄，并按要求采集、制備、儲存、運輸進行實驗處理。

3. 取樣的重復性

生物學重復的取樣應盡量減少重復間樣品的差異。在條件允許的前提下，做到重復樣 本在取材時間、部位、 處理條件等方面盡可能保持一致，否則可能會影響實驗結(jié)果的重復 性和可信度。

4. 取樣的及時性

樣本質(zhì)量是影響實驗結(jié)果的最關(guān)鍵因素，因此用于研究的實驗樣本，在采集、貯存、 運輸和制備的過程中盡可能地做到迅速，最大限度的縮短從樣本采集到實驗的時間。

5. 取樣的低溫性

所取樣本離體后，經(jīng)快速清洗和標記等處理后，應立即投入液氮中速凍至少 3 h，之后 保存于-80 ℃ 冰箱或者干冰中，確保在實驗操作前樣品始終處于-80 ℃，以避免 RNA 的降 解。

組織樣送樣量要求

DNA 提取組織送樣量要求

* 注：不同類型的組織樣品，DNA 的提取得率差別較大，像人或哺乳動物的全血中紅 細胞沒有細胞核，每毫升血液中實用細胞數(shù)少，DNA 得率比較低，送樣量需相應增加；而 鳥類或魚類血液中紅細胞含有細胞核，DNA 得率會增高，送樣量可適當減少。含肌纖維細 胞豐富的肌肉組織以及含多糖多酚較高的復雜植物，DNA 得率會受到影響。真菌的細胞有 含甲殼素（又叫幾丁質(zhì)）為主要成分的細胞壁，提取難度較大，建議盡量多準備一些樣品。

核酸送樣要求

1.送樣要求

1.1 術(shù)語及定義

1.1.1 檢測項目:

m：總量（Total quantity），DNA 的總質(zhì)量

c：濃度（Concentration），DNA 溶液的 Qubit 檢測濃度

N/Q：Nanodrop 檢測濃度與 Qubit 檢測濃度的比值

Size：片段大?。‵ragment size），指 DNA 分子片段主帶大小

OD260/280：Nanodrop 檢測中 OD260 和 OD280 的比值，反映 DNA 純度的指標之一

OD260/230：Nanodrop 檢測中 OD260 和 OD230 的比值，反映 DNA 純度的指標之一

1.1.2 樣品質(zhì)量檢測方法:

Nanodrop：使用 Thermo Fisher NanoDrop 2000/8000 Spectrophotometer 進行檢測的方法

Qubit：使用 Invitrogen Qubit Fluorometer 進行檢測的方法

AGE：Agarose Gel Electrophoresis 即使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測的方法

1.2 DNA 樣品送樣量要求

請?zhí)峁?DNA 樣品的相關(guān)檢測結(jié)果，例如以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE。請采取適當?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?DNA 樣品的污染，并詳細注明溶解 DNA 所使用的溶解液類型。

檢測結(jié)果說明：

level A：A 類樣品，指純度、片段大小和濃度均合格，總量滿足按數(shù)據(jù)量計算總量要求的 樣品。

level B：B 類樣品，指純度、片段大小和濃度均合格，總量不完全滿足按數(shù)據(jù)量計算總量 要求的樣品。

level C：質(zhì)量不完全滿足建庫要求，可以風險建庫但不保證文庫大小與測序數(shù)據(jù)量的樣品。

level D：質(zhì)量完全不滿足建庫測序要求，不建議使用的樣品。

請您按照上述 A 類樣品的要求來準備 DNA 樣品以確保后續(xù)建庫測序能夠正常進行。如果 您準備的 DNA 樣品不能滿足 A 類樣品指標要求，并且后續(xù)不能提供更多的 DNA 樣品， 需要提前聯(lián)系銷售人員進行咨詢。

2.二代核酸送樣要求

3.三代核酸送樣要求

樣本制備保存指南

1.植物組織

由于老葉或其它組織 DNA 含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對較高，因此， 為降低 DNA 提取難度并減少污染物干擾，請盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選 擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外 藻類組織中的水分會影響提取得率，取樣時需將組織樣中的水分吸干。新鮮組織樣采樣流 程如下：

1) 用 70%酒精將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織?

2) 樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，將處理好的組織樣本混合均勻后保存于 2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中；并標注編號。

3) 迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后按照順序依次放入樣品盒或者按照一定的規(guī)律（例 如 1-10,11-20 等）裝于自封袋中，轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存（禁止亂放，尤其是項目 中樣品個數(shù)較多時）；干冰運輸。

*注：

①一定不要使用自封袋常溫寄送非干燥組織樣，天氣炎熱，高溫下組織樣易腐爛變質(zhì)， 易產(chǎn)生霉菌，導致提取的核酸中混有污染物種的核酸或提取失敗，影響公司成本的同時 給客戶造成不好的影響。

②干燥樣品現(xiàn)在不建議送樣，提取成功率低，如果只有干燥樣品，使用紙質(zhì)袋裝樣，在 外包裝自封袋中可以統(tǒng)一裝硅膠干燥顆粒。

2.動物組織（不含昆蟲和水產(chǎn)類）

1) 活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、 可能有變異細胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織 類型。對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周 圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈）；

2) 迅速用預冷的 PBS 溶液（RNase free）或 0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

3) 如果組織體積較大，應盡量將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

4) 將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的存管中

5) 迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存，送樣時干冰運輸

注：整個樣品收集過程保證樣品斷血后半小時內(nèi)完成樣品制備

3.昆蟲

1）昆蟲樣本，建議進行表面微生物的清洗，較大個體的盡量選取不帶腸道部分的組織， 對于較小個體只能用整個個體的，建議進行適當?shù)酿囸I處理（但需注意保證昆蟲的活 性）。

2）如果組織體積較大，應盡量將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

3）將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的存管中

4）迅速置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存，送樣時干冰運輸

*注：蜜蜂送樣時盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常， 影響后續(xù)實驗。不建議送實驗室剔除，因為組織速凍過之后再剔除會化凍，提取降解的可 能性較大！

4.水產(chǎn)動物

1）取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體；

2）如果是甲殼類（如蝦蟹等），需解剖活體組織，只取軟肉組織，將組織樣品割成約 50 mg 的小塊（約黃豆大?。?/p>

3）液氮速凍后，放入干凈的帶螺紋旋蓋保存管中；

4）轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。

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5.細胞

一次提取反應所需細胞數(shù)≤1 X 10 7 個，以 3 X 10 6 -1 X 10 7 個為宜，可以將細胞經(jīng)裂解 液裂解后凍存運輸。

1) 從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細胞或懸浮培養(yǎng)的細胞，顯微鏡下觀察細胞，確定生長 狀態(tài)良好（正常細胞 confluence 在 80 %左右）

2) 棄去培養(yǎng)基，用 PBS 緩沖液快速洗一次，除去 PBS 緩沖液，貼壁細胞可用細胞刮 將其刮下

3) 收集的細胞轉(zhuǎn)入 1.5 mL 的 EP 管中用液氮速凍后置于-80 °C 保存，一管裝一次提 取的量，可以將備份樣品單獨裝，禁止將一個樣品多次提取的細胞裝到一個管中， 干冰運輸

注：由于細胞量少，干冰運輸務必保證細胞處于冷凍環(huán)境，防止環(huán)境溫度增加細胞降解； 同時因樣本少易降解，務必備注信息單微量樣本液氮交接

6.全血樣本

1) 用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，不可用肝素）的 旋蓋管收集全血樣本

2) 上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī) EP 管中，轉(zhuǎn)移至-20 或-80 °C 長期保存（實 際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3) 干冰運輸

注：

①血液采集管請盡量不要用需專門對應提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無 對應試劑盒影響提取時間（盡量送樣前溝通）

②采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至 EP 管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎不規(guī)范送樣玻璃管破碎 規(guī)范送樣

7.細菌

注意：所有菌類樣品必須分離好菌體或菌絲送樣，切勿連帶培養(yǎng)基一起寄送，帶培養(yǎng) 基的菌體無法提取。

1）顯微鏡下觀察細菌生長狀態(tài)，最好收集生長期處于對數(shù)期的細菌。

2）將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下 14000 ×g 離心 1 min。

3）棄掉培養(yǎng)基，將細菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍 1-3 h 以上（凍存時間視組織量 而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸。

8.真菌

真菌的形態(tài)多樣，一般分為單細胞和多細胞真菌，酵母菌屬于單細胞真菌，而霉菌和 蕈菌（大型真菌）都屬于多細胞的真菌。

8.1 單細胞真菌

單細胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應所需酵母菌的量需≤1×10 7個，以 5×10 6-1× 10 7個為宜。您要做的項目要求送樣量較大時，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨保 存。

1）顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，最好收集生長期處于對數(shù)期的酵母菌。

2）將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將 2 mL 旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于 室溫下 14000×g 離心 1 min。

3）棄盡培養(yǎng)基，將酵母細胞沉淀迅速置于液氮中冷凍 1-3 h 以上（凍存時間視組織 量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C 長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸。

8.2 大型真菌

大型真菌因種屬差異，生長形態(tài)差異很大。在制備大型真菌樣品時，可參考上述 1.1 植物組織制備方法。

核酸樣本

1) 第一種方案是提取完成后的 DNA 溶液直接放入-20 °C 冰箱中進行保存；第二種方案 是采用醋酸鈉乙醇沉淀法沉淀 DNA，并且將樣品直接放入-20 °C 冰箱中進行保存； 第三種方案是向沉淀后的 DNA 固體中直接加入 1 mL75 %的無水乙醇，并且將樣品 直接放入-30 °C 冰箱中進行保存；第四種方案是提取完成后的 DNA 樣品使用低溫冷 凍儀冷凍成干粉（可常溫運輸）

注：推薦用第一種方案

2) 樣品運送前保存在-20 °C 冰箱，干冰運輸