空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示大白菜葉球形成的關(guān)鍵過(guò)渡葉

 

研究背景

大白菜是一種重要的結(jié)葉蔬菜作物。在抽穗期，葉片內(nèi)外表現(xiàn)出明顯的形態(tài)分化。然而，這種復(fù)雜的葉片形態(tài)分化的遺傳控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期連續(xù)的頭葉從內(nèi)到外的轉(zhuǎn)錄組譜，通過(guò)在24個(gè)不同的葉片組織中展示了全基因組基因表達(dá)的序列-空間剖面，確定了可能在葉片抽穗中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵過(guò)渡頭葉片，為葉狀頭部的形成提供新見(jiàn)解。

材料方法

在溫室盆栽大白菜，使用11周大的植物進(jìn)行取樣。隨機(jī)選擇兩個(gè)正常生長(zhǎng)的大白菜。從外葉到內(nèi)葉的所有頭葉（葉長(zhǎng)>2cm）按順序分離收集，而帶有莖尖分生組織(SAM）的幼葉和小內(nèi)葉（葉長(zhǎng)<2cm）不分離，按順序收集。從每個(gè)大白菜頭部共得到30片葉子。從內(nèi)到外，每3片形態(tài)相似、大小相近的葉子為一葉輪，共得到10葉輪葉。

從每輪葉片中選取一片葉子，命名為L(zhǎng)1-L10，選擇SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。對(duì)于RNA-seq，L2被分為兩部分，葉柄(L2R2）和葉片(L2R1），對(duì)于L3、L5、L7和L9，則分為五個(gè)區(qū)域，包括頂部(R1）、外緣(R2）、葉片的中部區(qū)域(R3）、葉柄的頂部(R4）和中部(R5）區(qū)域進(jìn)行采樣。對(duì)來(lái)自?xún)蓚€(gè)生物學(xué)重復(fù)（兩個(gè)葉頭）共計(jì)48個(gè)樣品用Illumina平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

研究結(jié)果

1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

對(duì)48個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共產(chǎn)生7.43×108高質(zhì)量cleanreads，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.92-0.99，所有生物學(xué)重復(fù)都高度相關(guān)。將cleanread與大白菜參考基因組進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算基因表達(dá)量TPM值，共鑒定出27,876個(gè)基因。其中，75.08%的基因在所有樣品中都有表達(dá)。

主成分分析(PCA）顯示沿主成分(PC）1和2有明顯的分離。PC1根據(jù)與SAM的距離將葉片樣本分開(kāi)，而PC2將葉片和葉柄組織分開(kāi)。層次聚類(lèi)分析將樣本分為五類(lèi)，與葉子形態(tài)分化一致。SAM和L1的樣本形成內(nèi)葉1(IL1）最接近莖尖的組織。內(nèi)葉2的葉片（IL2B）和內(nèi)葉2的葉柄（IL2P）代表L2-L5的葉片和葉柄組織，而外葉（OLB）和外葉柄（OLP）代表L2-L5的葉片和葉柄組織外葉（L7和L9），與葉子形態(tài)分化一致。

2、差異表達(dá)基因分析

作者在全基因組水平上鑒定了不同葉片中的差異表達(dá)基因（DEG），以探索葉片之間的多樣性和潛在功能。通過(guò)分析，共發(fā)現(xiàn)9,133DEG，k-means聚類(lèi)將差異基因分為14個(gè)共表達(dá)簇(CEC1-CEC14），這些CEC與圖1中的5個(gè)聚類(lèi)簇緊密相關(guān)。IL1中DEGs的高表達(dá)水平以CEC1和2為代表。CEC1在SAM中高度表達(dá)，并以與分生組織發(fā)育、組織發(fā)育和近軸/遠(yuǎn)軸極性相關(guān)的基因?yàn)榇?。CEC2在SAM和L1高表達(dá)，包含與細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)和生長(zhǎng)素生物合成過(guò)程相關(guān)的基因。IL2B中DEG的高表達(dá)水平以CEC4-6為代表。CEC4、5和6均富集于有機(jī)酸代謝過(guò)程、淀粉代謝過(guò)程、質(zhì)體組織和硫苷代謝、光合光反應(yīng)等過(guò)程。IL2P中DEGs的高表達(dá)以CEC9為代表。CEC9富含植物細(xì)胞壁相關(guān)過(guò)程，包括壁組織或生物發(fā)生，以及果膠代謝過(guò)程。OLB中DEGs以CEC7和8為代表。CEC7在L7葉片中高表達(dá)，并以與蛋白質(zhì)修飾過(guò)程、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性相關(guān)的基因?yàn)榇?。這些結(jié)果反映L7具有明顯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控特征。CEC8在L9葉片中高表達(dá)，含有一組與葉綠素分解代謝過(guò)程、細(xì)胞分解代謝過(guò)程、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、果糖反應(yīng)和脫落酸激活信號(hào)通路相關(guān)的基因。OLP中DEG的高表達(dá)水平以CEC11和12為代表。CEC11中的基因在L7-L9的葉柄中高度表達(dá)，在任何基因本體(GO）術(shù)語(yǔ)中均未富集。CEC12中的基因在L9的葉柄中高度表達(dá)。這些基因可能主要參與脫落酸激活的信號(hào)通路、茉莉酸（JA）代謝過(guò)程、JA反應(yīng)、防御反應(yīng)、生物刺激反應(yīng)、水楊酸反應(yīng)和外部刺激反應(yīng)。這些結(jié)果表明，L9可能在保護(hù)多葉頭部免受外部損害方面發(fā)揮作用。

3、葉片發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)揭示葉球形成中的關(guān)鍵過(guò)渡葉

作者鑒定了細(xì)胞增殖相關(guān)基因和細(xì)胞擴(kuò)張相關(guān)基因。結(jié)果表明，大多數(shù)細(xì)胞增殖基因在IL1HLs中達(dá)到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下調(diào)(圖3A），表明細(xì)胞增殖基因在不斷生長(zhǎng)的內(nèi)葉的起始過(guò)程中發(fā)揮重要作用。與細(xì)胞增殖基因不同，大部分細(xì)胞擴(kuò)張基因在IL2HLs和外HLs的葉片區(qū)域高表達(dá)，且表達(dá)模式更為多樣，分為4個(gè)簇(圖3A）。此外，大部分細(xì)胞擴(kuò)張基因在IL2HLs和外層HLs之間表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，導(dǎo)致L7細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張調(diào)控的變化明顯高于IL2HLs和外層葉(圖3B）。

大白菜HLs的彎曲通常被認(rèn)為是由葉片正軸和背軸之間的不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞生長(zhǎng)引起的。通過(guò)分析ad-ab極性基因的表達(dá)模式，以探究ad-ab極性基因在頭葉曲率中的作用。結(jié)果表明，與內(nèi)部HL相比，大多數(shù)ad-ab極性基因在外部HL中顯示出顯著不同的表達(dá)模式。

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、PCA和聚類(lèi)分析，以及與細(xì)胞分裂/擴(kuò)張和ad-ab極性相關(guān)的基因表達(dá)，L7位于內(nèi)葉和外葉之間的邊界。作者通過(guò)主成分分析和聚類(lèi)將L7分類(lèi)為外葉組，最終確定L7是顯示三種模式的過(guò)渡狀態(tài)。此外，作者進(jìn)一步分析了HLs中可溶性糖的積累和相關(guān)基因的表達(dá)特征，進(jìn)一步證實(shí)L7是葉狀頭部發(fā)育的關(guān)鍵過(guò)渡葉。

4、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為確定導(dǎo)致過(guò)渡葉特殊狀態(tài)的形成過(guò)程，作者進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）。WGCNA共確定了17個(gè)模塊。其中，五個(gè)模塊（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）與過(guò)渡葉密切關(guān)聯(lián)。兩個(gè)模塊，greenyellow和magenta，與過(guò)渡葉特別相關(guān)，并包含許多編碼蛋白激酶的基因，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK）、鈣依賴(lài)性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受體樣激酶。關(guān)鍵過(guò)渡葉片L7可能受到復(fù)雜信號(hào)相互作用的調(diào)節(jié)，不僅是光和其他外部刺激，也有內(nèi)部激素。

文章亮點(diǎn)

作者報(bào)道了大白菜抽穗期的轉(zhuǎn)錄組圖譜，利用24個(gè)空間解剖組織，分別代表大白菜內(nèi)外葉的不同區(qū)域。全基因組轉(zhuǎn)錄組分析清楚地將內(nèi)葉組織與外葉組織分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)對(duì)葉片發(fā)育和糖代謝關(guān)鍵基因的空間表達(dá)分析，確定了關(guān)鍵過(guò)渡葉，關(guān)鍵過(guò)渡葉是第一批內(nèi)彎的葉片。關(guān)鍵過(guò)渡葉的形成由一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)控制，不僅包括內(nèi)部激素和蛋白激酶，還包括外部光和其他刺激。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為揭示抽穗性狀的遺傳控制提供了新的見(jiàn)解和豐富的資源。研究過(guò)程中作者利用生活中常見(jiàn)材料，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，思路簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)巧妙，值得借鑒學(xué)習(xí)。

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