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發(fā)布于 2021年12月22日

1.多糖多酚中的RNA為什么難提??？

從多糖多酚植物樣本中，如何提取到質量較好的RNA，是許多科研人員最頭疼的事情，因為多糖多酚會降低RNA提取純度&濃度。常見的水果如蘋果、柑橘、草莓、樹莓、葡萄；常見的農(nóng)作物如馬鈴薯、煙草、棉花等；中草藥如半夏、石斛、靈芝等，都含有大量的多糖多酚。那么為什么多糖多酚植物RNA較難提取呢？具體原因有3點：

1.RNA為單鏈結構，易降解，且含有2’-OH基團，易發(fā)生氧化還原反應，分子結構不穩(wěn)定。

2.遍布各處的RNase（RNA水解酶）能催化RNA降解，且酶活高不易清除。

3.部分植物樣本富含多糖、多酚，或含有某些尚無法確定的次級代謝產(chǎn)物,干擾RNA的質量。

多糖：其理化性質與RNA相似，在去除多糖過程中會裹挾大量的RNA，導致RNA的得率降低；同時在RNA沉淀過程中，多糖也會和RNA形成凝膠沉淀，導致RNA純度過低；多糖還會影響一些酶的活性，降低建庫成功率。

酚類：細胞裂解后，酚類化合物遇空氣極易氧化成醌類。與RNA不可逆結合，從而影響其純度。越成熟的組織酚類含量越高，幼嫩組織提取難度較小。

[注意]：在裂解液中加入抗氧化劑，可抑制RNase酶活性，并減輕酚類物質的影響。

次級代謝產(chǎn)物：成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，易與RNA結合，降低RNA提取的質量。

2.RNA提取方法

目前市場上常見的提取RNA的方法，包括Trizol法、SDS-苯酚法、試劑盒法等。這些方法各有優(yōu)缺點，具體如下：

（一）TRIzol法

TRIzol主要成分：苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚得到釋放。異硫氰酸胍是強有力的蛋白質變性劑，能迅速溶解蛋白質，導致細胞結構破碎，釋放出核酸。

優(yōu)點：操作簡單、RNA提取完整性好、適用于一些次生代謝物含量少的植物組織。

缺點：苯酚不能完全抑制RNAse活性，完成RNA部分損失。

（二）SDS-苯酚法

SDS和苯酚能夠使蛋白質變性、抑制內源性RNase的活性，同時裂解細胞膜，釋放出所需要的RNA。而且苯酚可以將溶液中蛋白質、多糖、DNA 分層到有機相中，而RNA則留在上清溶液中。

優(yōu)點：操作簡單，省時省力。

缺點：提取過程中，無法清除大量的多糖多酚，導致提取的RNA純度降低，無法保證后續(xù)建庫測序實驗的進行。

（三）試劑盒法

目前市場上有許多專門用于多糖多酚植物RNA提取試劑盒，試劑盒中的裂解液可以裂解植物樣本，鹽酸胍抑制RNase的活性；β-巰基乙醇抑制RNase的活性同時使蛋白變性，最后通過離心柱上的吸附膜，特異性吸附RNA。

優(yōu)點：操作簡便、快捷、不需要加入氯仿等有機溶劑；RNA純度高，適用于下游定量、建庫、測序等實驗。

缺點：必須是新鮮或者未反復凍融的植物樣本；提取操作不當，可能會堵塞濾膜。

3.RNA質量檢測

提取完RNA后，都要進行一系列的質量驗證，質量合格的RNA，才能用于后續(xù)的建庫、測序、熒光定量等實驗。一般需要對RNA的濃度、純度、完整性進行檢測，具體檢測方法&標準如下：

1.RNA濃度&純度檢測：一般需要通過紫外分光光度計，檢測RNA在260 nm的吸光度。純RNA：OD260/OD280≈2.0

表1：通過紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度

2.完整性檢測：可以通過凝膠電泳法和檢測RIN值，來判斷RNA的完整性。凝膠電泳法真核生物RNA進行跑膠后，有三個亮度不一樣的條帶，分別是28S、18S、5S。一般28S條帶最亮，18S次之，5S條帶最弱甚至看不見。若28S條帶的亮度大概是18S條帶的兩倍或者以上，這種情況RNA的質量是很好的。如下圖所示

圖1：凝膠電泳檢測RNA完整性（圖片來源于網(wǎng)絡）。

3.Agilent 2100儀器檢測RIN值

RNA Integrity Number （RIN）值大小反映了RNA的完整性，一般認為RIN值范圍為6.3-10.0，就說明RNA完整。RIN值越接近10，表明RNA完整性越好，反之完整性越（特殊樣品需結合基線綜合評估）。Agilent 2100儀器不僅可以檢測RIN值，還可以得到RNA的濃度和28S/18S比值（原核生物為23S/16S）。