snRNA-seq|靈長類動物心肺的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜揭示新冠易感人群

導(dǎo)讀

研究背景：

年齡老化使我們更容易感染慢性病和微生物感染的傷害。常見的老年相關(guān)疾病如心血管病（CVD）和慢阻肺?。–OPD），是老年人死亡的第一大和第三大原因。2019年以來，新型冠狀病毒引發(fā)的肺部感染(COVID-19)席卷全球，給人們的生命健康造成嚴(yán)重威脅。目前，該病毒全球累計感染6554余萬人，其中死亡人數(shù)高達(dá)150多萬。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計，住院死亡病例中超過70%為年齡65歲以上的老年人。新冠患者多表現(xiàn)為呼吸急促、心血管功能受損等一系列癥狀。與年輕群體相比，老年群體對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）更加易感，且更易發(fā)展為重癥、甚至死亡。但目前感染機(jī)制尚不清楚，所以我們迫切需要解決與高等哺乳動物衰老相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)制。

方法與結(jié)果：

本文中，作者構(gòu)建了年輕和年老的非人類靈長類動物的肺、心臟和動脈的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組圖譜，這些是SARS-CoV-2靶向的主要組織。對細(xì)胞類型特異性衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄改變的分析顯示，全身炎癥增加和病毒防御受損是心肺衰老的標(biāo)志。隨著年齡的增長，肺泡上皮屏障、心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中SARS-CoV-2受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)的表達(dá)增加。我們發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素7(IL7)在老年樣本的心肺組織富集，并以NF -κB依賴的方式誘導(dǎo)ACE2在人類血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。此外，維生素C抑制了IL7誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)。
結(jié)論：
作者描繪了年老的靈長類心肺系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄圖譜，并提供了關(guān)于年齡相關(guān)的SARS-CoV-2易感性的重要見解，這表示神經(jīng)保護(hù)策略可能降低老年人中COVID-19的嚴(yán)重程度。

材料與方法

作者以食蟹猴為研究對象，選取了4~6歲（相當(dāng)于青壯年20歲）幼齡和18~21歲（相當(dāng)于老年人79歲左右）的食蟹猴，通過單細(xì)胞核測序方法進(jìn)行單細(xì)胞圖譜的繪制；
方法：RNA-seq，單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq）等

實(shí)驗結(jié)果

分別對兩組樣品選取肺和心臟組織進(jìn)行單細(xì)胞核測序（圖1a）。與幼齡猴肺相比，老年猴肺的特征是肺泡增大、纖維化增加和脂肪沉積（圖1b）。此外，在老年猴心臟中出現(xiàn)脂肪浸潤。同時，衰老的肺和心臟表現(xiàn)出較高水平的半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色，而這個是細(xì)胞衰老的特征（圖1c）。通過單細(xì)胞核測序，共獲得150000個細(xì)胞，利用UMAP聚類分析，鑒定了具有不同細(xì)胞特征的19中肺細(xì)胞和18中心臟細(xì)胞。利用已知細(xì)胞特征進(jìn)行再次鑒定，在肺中，鑒定到了AT1和AT2、纖毛細(xì)胞（CCs）、內(nèi)皮細(xì)胞等，并鑒定出7中免疫細(xì)胞，包括AMs、IMs、B細(xì)胞、T細(xì)胞等（圖1d）。在心臟中，鑒定了肥厚性心肌細(xì)胞（H-CMs）、心外膜細(xì)胞、兩種神經(jīng)傳導(dǎo)細(xì)胞等，并鑒定出5種免疫細(xì)胞（圖1g）。通過GO數(shù)據(jù)庫注釋和轉(zhuǎn)錄組分析顯示，細(xì)胞類型在靈長類動物衰老過|中沒有明顯影響。研究顯示作者的數(shù)據(jù)代表了年輕和年老靈長類動物肺和心臟的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜。

圖1

為了闡明細(xì)胞水平上與衰老相關(guān)的分子機(jī)制，作者在個性肺細(xì)胞中識別和衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組變化。通過差異分析（| logFoldChange（logFC）| 0.25，調(diào)整后的P值<0.05）顯示，共獲得1356個差異基因（圖2a）。衰老過程中受影響最大的細(xì)胞包括AMs、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、AT1和AT2，在老年和青年肺亞型中分別有372、262、239、235和217個差異基因。通過數(shù)據(jù)庫注釋，這些基因包含了肺部疾?。–OPD、肺炎、肺纖維化、哮喘等）的熱點(diǎn)基因。下調(diào)的DEGs參與上皮細(xì)胞增值、止血和表面活性物質(zhì)代謝（圖2c），提示衰老過程中肺功能受損。此外，SASP相關(guān)基因在10中類型細(xì)胞中過表達(dá)（圖2d），表明老年肺以細(xì)胞應(yīng)激和慢性炎癥為特征。具體來說，上調(diào)的DEGs與囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)（圖2c），這可能構(gòu)成病毒內(nèi)化的一個貢獻(xiàn)者。在蛋白水平上，通過免疫熒光分析證實(shí)了缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子HIF1在老年肺中表達(dá)上調(diào)，提示老年肺可能發(fā)生明顯的缺氧應(yīng)激反應(yīng)，這可能是導(dǎo)致深度衰老的原因之一。通過上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征分析，觀察到21個囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因在AT2細(xì)胞中，這可能與病毒的進(jìn)入、組裝等相關(guān)。因此，這些結(jié)果揭示了衰老可能導(dǎo)致肺泡上皮屏障功能衰退以及病毒防御能力受損。

圖2

總的來說，老年肺組織中許多免疫細(xì)胞類型的比例增加，包括肥大性細(xì)胞和漿細(xì)胞，他們分泌細(xì)胞因子和抗體導(dǎo)致年齡相關(guān)性炎癥、慢阻肺病和肺纖維化的比例增加。 為了探索衰老心臟中細(xì)胞特異性的分子機(jī)制，作者篩選出了1857個差異基因（|logFC| > 0.25, P value < 0.05）（圖3a），其中數(shù)十個基因是肥厚型心肌病的熱點(diǎn)基因（圖3b）。反映了心臟中與年齡相關(guān)的基因表達(dá)變化與老年人心臟病高發(fā)之間的緊密聯(lián)系。

通過對免疫細(xì)胞分析，在衰老的心臟中，免疫細(xì)胞和外周細(xì)胞的整體通信頻率增加，表明心臟免疫失調(diào)是心臟老化的一個重要特征。

圖3

為了識別可能被SARS-CoV-2靶向的細(xì)胞類型，作者分析了ACE2、TMPRSS2、FURIN和其他可能的輔助蛋白的細(xì)胞特異性的表達(dá)模式。在肺中，ACE2在AT2（7%）、AT1（1%）、纖毛細(xì)胞（3%）等類型中表達(dá)（圖4b-d），另外還發(fā)現(xiàn)，一小部分內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ACE2、AECs、CECs均表達(dá)為0.2%，AT2和AT1中檢測到大多數(shù)ACE2和TMPRSS2雙陽性細(xì)胞。組織蛋白酶家族成員的FURIN、CTSB、CTSL等膜錨定蛋白酶與ACE2共表達(dá)。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)AT2和AT1是肺中COVID-19的易感細(xì)胞類型。有趣的是，衰老細(xì)胞中ACE2陽性的AT1細(xì)胞比例增加了約2倍。更重要的是，衰老過程中，NHP和人肺部的免疫染色均證實(shí)了肺泡周圍ACE2陽性細(xì)胞的增加，提示隨著年齡的增長，肺泡表面更容易感染SARS-CoV-2的細(xì)胞比例增加。

圖4

最后，作者試圖探索哪些與衰老相關(guān)的因素可能介導(dǎo)靈長類組織中ACE2的上調(diào)、因為大量RNA-seq分析顯示，IL7不僅在老年人肺部、心臟和主動脈普遍上調(diào)，同時，也是導(dǎo)致COVID-19患者免疫過度反應(yīng)的細(xì)胞因子之一。研究發(fā)現(xiàn)，IL7的刺激在測試的時間內(nèi)上調(diào)了ACE2的表達(dá)，在藥物治療后兩天達(dá)到了最高的記錄。另外，IL7對HAECs的處理通過Western blot分析顯著上調(diào)了ACE2的表達(dá)水平。因此，這些結(jié)果表明，IL7在靈長類動物衰老期間，至少在HAEC中，在上調(diào)ACE2表達(dá)中起關(guān)鍵作用。而維生素C的預(yù)處理會使HAEC中IL7誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)減弱。

總結(jié)

在這項研究中，研究人員分析了老年靈長類動物呼吸道和心血管組織的單核轉(zhuǎn)錄組圖譜，以了解其易受年齡相關(guān)疾病和COVID-19侵害的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)靈長類動物肺部和心血管衰老的關(guān)鍵特征包括受損的組織穩(wěn)態(tài)和病毒防御能力以及激活炎癥反應(yīng)。提出將抗神經(jīng)保護(hù)劑重新用于COVID-19治療，尤其是對于弱勢老年患者，可能是預(yù)防和治療策略之一。另外阻斷IL7信號傳導(dǎo)可能有助于降低全身或局部ACE2水平并緩解SARS-CoV-2癥狀。