高分轉(zhuǎn)錄組研究思路|2020年百邁客醫(yī)學(xué)高分案例集錦-上

今年疫情突發(fā)，不知不覺已經(jīng)和疫情抗戰(zhàn)了大半年，九月倏然而至。北京的夏天真是酷熱，前不久去陰雨綿綿的昆明，竟嗅到清甜的“三秋桂子”，心中不禁驚詫：原是秋到了。

秋天本是豐收的季節(jié)，百邁客醫(yī)學(xué)今秋有何收獲呢？嗯，言歸正傳，接下來我們要講一講今年，2020年，百邁客醫(yī)學(xué)的文章碩果。我們看一看課題如何設(shè)計(jì)，怎么利用測(cè)序技術(shù)發(fā)文章。下面整理了部分5分以上的百邁客醫(yī)學(xué)合作文章研究思路簡(jiǎn)介。

 

案例一：轉(zhuǎn)錄組多組學(xué)解析揭示Tfr1基因?qū)γ咨窘M織的產(chǎn)熱能力以及分化的影響

在寒冷刺激下或者β腎上腺素能受體激動(dòng)劑處理后，WAT白色脂肪組織中會(huì)出現(xiàn)散在的棕色樣脂肪細(xì)胞，稱為“棕色/米色脂肪”組織Brown/Beige adipose tissue，屬于產(chǎn)熱脂肪。鐵穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持多種細(xì)胞類型的細(xì)胞功能至關(guān)重要。但是，鐵是否會(huì)影響脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱特性目前尚不清楚。

研究思路：本文首先從3個(gè)組學(xué)：β腎上腺素能受體激動(dòng)劑CL-316,243處理的米色脂肪細(xì)胞活躍啟動(dòng)子標(biāo)記H3K9/14Ac Chip-seq 以及生理鹽水對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行RNA-seq、iTRAQ蛋白組測(cè)序，多組學(xué)整合分析鑒定調(diào)控米色脂肪細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵候選基因Tfr1。再通過構(gòu)建候選基因敲除小鼠模型，從表型、組織、基因表達(dá)（RNA-seq）、蛋白表達(dá)到機(jī)制，層層遞進(jìn)，逐步由淺到深解析。最終發(fā)現(xiàn)Tfr1通過鐵依賴性和非鐵依賴性機(jī)制在產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞中起重要作用。

 

 

案例二：成纖維細(xì)胞重編程為自組織的感覺神經(jīng)節(jié)類器官和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

文章題目:Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts

雜志&IF:Sci Adv,IF=13.116

合作單位：中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心

鑒于類器官的優(yōu)勢(shì)，在研究發(fā)育機(jī)制以及對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行建模和治療方面，作者試圖使用可控制體內(nèi)感覺和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子TF，將小鼠和人成纖維細(xì)胞重編程為神經(jīng)節(jié)類器官和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGC。SG體感神經(jīng)節(jié)和RGC之間廣泛的分子同源性，區(qū)分這2種類型的神經(jīng)元是一個(gè)難題，需要篩選RGC特異性標(biāo)記，需要篩選誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞自組織和網(wǎng)絡(luò)化的iSG(induced SG)和iRGC(induced RGCs)的最有效方法。

研究思路：通過對(duì)多個(gè)SG和RGC 轉(zhuǎn)錄因子TF的篩選，作者確定了三個(gè)TF組合ABI是重編程小鼠和人類成纖維細(xì)胞為自組織和網(wǎng)絡(luò)化iSG類器官的最有效組合。通過免疫染色、qRT-PCR、全細(xì)胞膜片鉗記錄、鈣成像以及混合bulk轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組scRNA-seq方法，能夠證明iSG類器官具有分子和細(xì)胞特征、亞型多樣性、電生理特性和周圍神經(jīng)支配能力和周圍SG的特征模式。此外，使用免疫標(biāo)記和scRNA-seq分析，鑒定出了真正的RGC特異性分子標(biāo)記，以證明ABI組合具有從成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)少量iRGC的額外能力。不同于iSG神經(jīng)元，iRGC保持類似于視網(wǎng)膜中內(nèi)源性RGC的分散分布模式。

 

 

案例三：間充質(zhì)干細(xì)胞和各種眼細(xì)胞之間通過線粒體的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)生物能crosstalk

文章題目:Bioenergetic Crosstalk between Mesenchymal Stem Cells and various Ocular Cells through the intercellular trafficking of Mitochondria

雜志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作單位：溫州醫(yī)學(xué)院附屬眼視光醫(yī)院視網(wǎng)膜再生醫(yī)療研究組&首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院北京市眼科研究所

線粒體疾病會(huì)優(yōu)先影響人眼中能量需求較高的組織，例如視網(wǎng)膜和角膜內(nèi)皮。基于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的治療已被證明對(duì)眼部變性有益。但是，除了神經(jīng)保護(hù)性旁分泌作用外，MSC對(duì)視網(wǎng)膜和角膜組織有益作用的潛在機(jī)制在很大程度上尚不清楚。這項(xiàng)研究中試圖探究從MSC到眼細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的線粒體的命運(yùn)和相關(guān)特征。

研究思路：將MSC與角膜內(nèi)皮細(xì)胞（CEC）、661W細(xì)胞（感光細(xì)胞系）和ARPE-19細(xì)胞（視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系）共培養(yǎng)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)、熒光激活細(xì)胞分選和共聚焦顯微鏡成像探究細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的線粒體的特性和命運(yùn)。測(cè)量受體細(xì)胞的耗氧率以研究細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移的影響。進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析以研究具有轉(zhuǎn)移線粒體的受體細(xì)胞中代謝基因的表達(dá)。結(jié)果：線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)/“捐贈(zèng)”是MSC與各種眼細(xì)胞（包括角膜內(nèi)皮，視網(wǎng)膜色素上皮和感光細(xì)胞）之間普遍存在的細(xì)胞間機(jī)制。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)過程取決于基于F-肌動(dòng)蛋白隧道納米管。接受MSC線粒體的魚藤酮預(yù)處理細(xì)胞顯示出增加的有氧能力和線粒體基因的上調(diào)?；铙w成像技術(shù)確定了轉(zhuǎn)移的線粒體的最終命運(yùn)：通過溶酶體降解或通過胞吐作用形成細(xì)胞外囊泡。結(jié)論：首次確定了線粒體通過基于F-肌動(dòng)蛋白隧道納米管從MSCs向各種眼細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的特征和命運(yùn)，有助于表征基于MSC的眼組織再生治療方法。

案例四：長期培養(yǎng)過程中維生素C通過抑制Notch3延緩牙周膜干細(xì)胞衰老

牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）作為牙周組織修復(fù)和再生的潛在“種子細(xì)胞”，需要在體外進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增。長期培養(yǎng)過程中發(fā)生的PDLSC衰老可能會(huì)損害PDLSC的治療效果。培養(yǎng)基補(bǔ)充劑可用于抗衰老。然而，長期培養(yǎng)過程中維生素C（Vc）處理對(duì)PDLSCs的作用和機(jī)制仍不清楚。

研究思路：在長期培養(yǎng)過程中，經(jīng)Vc處理的PDLSCs細(xì)胞保持細(xì)長的形態(tài)，較高的生長速率和遷移能力，干性和成骨分化能力。此外，低傳代次數(shù)EP vs 高傳代次數(shù)LP vs LP+Vc處理轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，Notch3在細(xì)胞衰老過程中顯著上調(diào)，Vc處理通過抑制長期培養(yǎng)過程中的Notch3延緩了PDLSCs的衰老。總之，Vc處理通過減少Notch3的表達(dá)來抑制PDLSCs的衰老，這可能是一種在細(xì)胞長期培養(yǎng)過程中抑制細(xì)胞衰老的簡(jiǎn)單而有用的策略。

 

 

案例五:慢性酒精攝入和HBV通過HBx-SWELL1- 花生四烯酸信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝異常并激活HBV-Tg小鼠Treg細(xì)胞

文章題目:Chronic ethanol consumption and HBV induce abnormal lipid metabolism through HBx/SWELL1/arachidonic acid signaling and activate Tregs in HBV-Tg mice

雜志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作單位：南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)研究所腫瘤研究室

慢性酒精攝入已成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題，它在感染了乙肝病毒（HBV）的患者中促進(jìn)了慢性肝病的發(fā)展?；ㄉ南┧岽x物前列腺素E2（PGE2）可激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的功能。本研究旨在發(fā)現(xiàn)慢性乙醇酒精攝入導(dǎo)致HBV誘導(dǎo)的異常脂質(zhì)代謝增強(qiáng)和Tregs激活的潛在機(jī)制。

研究思路：通過ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定體內(nèi)和體外花生四烯酸代謝物PGE2和LTD4含量。通過TCGA公共數(shù)據(jù)分析篩選到與肝癌預(yù)后和診斷相關(guān)的SWELL1基因。使用siRNA減弱HepG2、HepG2.2.15肝癌細(xì)胞系和K180食管癌細(xì)胞系中SWELL1的表達(dá)，然后對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。Western blot分析和RT-qPCR用于檢查臨床HCC樣本和細(xì)胞系中的HBx（乙型肝炎病毒X基因）、SWELL1和轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達(dá)。通過流式細(xì)胞術(shù)在HBV-Tg小鼠（HBV全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型）中測(cè)試了慢性酒精攝入對(duì)Tregs的影響，收集酒精攝入組和對(duì)照組脾臟Tregs細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果：體內(nèi)和體外觀察到乙醇/酒精和乙肝病毒在脂質(zhì)代謝異常中的協(xié)同作用，SWELL1（或HBx）的降低導(dǎo)致脂質(zhì)含量和花生四烯酸代謝產(chǎn)物減少，乙醇和SWELL1可升高小鼠和細(xì)胞系肝臟中PGE2或LTD4的水平。乙醇通過激活HBx/Sp1/SWELL1/花生四烯酸信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝異常。慢性酒精攝入顯著增加了HBV-Tg小鼠的PBL(外周血淋巴細(xì)胞) Tregs和脾臟Tregs的數(shù)量，這與體內(nèi)和體外PD-L1表達(dá)的增加一致。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，在以乙醇攝入小鼠或HBV-Tg小鼠的Tregs細(xì)胞中多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變。結(jié)論：長期攝入乙醇可通過HBx/SWELL1/花生四烯酸信號(hào)增強(qiáng)HBV誘導(dǎo)的異常脂質(zhì)代謝，并激活小鼠的Tregs功能。