BSA（bulked segregant analysis）又叫集群分離分析法，該方法主要是選擇雙親群體分離后代中具有極端表型的個體進行混樣，通過比較不同極端混樣池之間的多態(tài)性標記的差異，從而篩選出與性狀相關的分子標記，實現(xiàn)目標基因的定位。BSA分析早期使用的都是傳統(tǒng)分子標記，根據(jù)標記與性狀共分離（緊密連鎖）得到定位區(qū)間，不過由于其標記密度低、定位精度差、實驗操作繁瑣已經(jīng)逐漸不再使用。近年來，BSA方法和高通量測序相結合，通過比較不同混池間SNP的頻率差異或者比較混池間純合SNP的密度的差異，實現(xiàn)基因的定位，高通量測序方式以其簡單、快速、準確、高性價比的特點受到科研工作者的青睞。那么，對于不了解BSA的研究者來說，如何快速了解BSA的發(fā)展歷程、原理方法、應用領域，如何快速上手BSA分析，今天大師兄為大家推薦幾篇BSA代表性文章，讓你輕松搞定BSA，趕緊上車。
BSA的提出
文章題目：Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations
發(fā)表期刊：PNAS
發(fā)表年份：1991
文章要點：
（1）在這篇文章中BSA方法被首次提出來，是BSA的開山鼻祖。
（2）該文章利用傳統(tǒng)的RAPD標記，首先通過篩選親本間多態(tài)標記，然后在性狀分離的雜交群體中選擇性狀極端個體組成混池，根據(jù)多態(tài)標記與混池性狀共分離的原理，獲得與性狀連鎖的markers。
（3）利用該方法，作者對萵苣霜霉病抗性基因進行的了定位。
?圖1?BSA方法篩選共分離標記
BSA的進階
1、文章題目：Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap
發(fā)表期刊：Nature Biotechnology
（1）該文章提出了一種針對化學誘變劑的點突變性狀的定位方法—mutmap，該方法是目前在做植物誘變性狀研究的主要方法。
（2）該方法使用突變個體與其野生型個性進行雜交得到F2群體，在群體中選擇突變表型的子代組成1個突變混池，然后只對混池DNA進行高通量測序。
（3）該方法中首次提出了SNP-index的概念，SNP-index是目前最常用的BSA定位方法之一，即計算混池中非參考基因組類型的SNP的頻率，同時再利用滑窗法對連續(xù)多個SNP的SNP-index值進行擬合，最終獲得性狀關聯(lián)的基因組區(qū)間。
（4）作者利用該方法對水稻夜色突變基因進行了定位，并且在chr12的尾部定位一個候選基因OsCAO1。
圖2?mutmap定位原理示意圖
2、文章題目：MMAPPR: Mutation Mapping Analysis Pipeline for Pooled RNA-seq
（1）該文章首次提出了MMAPPR的方法對突變性狀進行基因定位，該方法最大的亮點是對極端個體混池的RNA進行測序，而不再是混池的DNA進行重測序，這對于基因組較大的物種來說無疑不是一種最佳選擇。
（2）對于沒有親本的雜交子代群體，首次將歐式距離算法（Euclidean distance，ED）應用到性狀關聯(lián)分析中，同時提出通過ED值乘冪的方式實現(xiàn)背景噪音的過濾。
（3）在性狀關聯(lián)時，使用了LOESS擬合的方法對ED乘冪值進行擬合，獲得顯著關聯(lián)的基因組區(qū)間。
（4）利用該方法，作者對斑馬魚心血管突變體性狀進行了分析，最終定位到2個候選基因ctr9和cds2。
圖3?MMAPPR的定位過程
3、文章題目：MutMap+: Genetic Mapping and Mutant Identification without Crossing in Rice
（1）該文章是對突變性狀定位的一種延伸，也是對mutmap方法的一個補充，主要區(qū)別是如果隱形突變個體無法正常發(fā)育在幼苗期出現(xiàn)死亡，因此無法與野生親本雜交構建分離群體，所以該方法巧妙的選擇了突變位點雜合的個體進行自交，從而在自交M3或者M4選擇極端個體構建混池進行后續(xù)分析。
（2）該方法為了避免SNP在自交過程中的固定效應和群體中的偏分離標記，不再像mutnap分析中對一個突變性狀混池進行測序，而是對2個極端混池都進行測序，從而降低了背景噪音。
（3）在SNP-index關聯(lián)算法的基礎上，進一步發(fā)展提出△SNP-index算法，通過△SNP-index的大小判斷性狀關聯(lián)區(qū)域。
（4）利用該方法對水稻淺綠葉色突變進行了分析，定位并驗證了OsNAP6基因的功能。
?圖4 MutMap+的定位過程
4、文章題目：QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations
發(fā)表期刊：The Plant Journal
（1）前期的BSA定位方法主要集中在發(fā)生突變的質量性狀上，該文章提出了針對植物數(shù)量性狀的研究方法QTL-seq。如果一個性狀是由多基因調控，分離群體子代的性狀呈現(xiàn)正態(tài)分布，QTL-seq方法選擇極端表型的部分子代構建混池并進行高通量測序，該方法是目前數(shù)量性狀定位的主流方法。
（2）對于SNP-index關聯(lián)值提出了置信區(qū)間的算法，將定位結果鎖定在基因組某個區(qū)間范圍內。
（3）利用該方法作者對水稻稻瘟病菌抗性進行了定位，并且在chr6頭部定位到一個顯著的關聯(lián)峰。
?圖5 QTL-seq的定位過程
BSA的升級
1、文章題目：QTG-Seq Accelerates QTL Fine Mapping through QTL Partitioning and Whole-Genome Sequencing of Bulked Segregant Samples
（1）該方法是整合了遺傳圖譜QTL定位、回交子代背景選擇、QTL-seq于一體的綜合方案，項目開展前需要經(jīng)過精心的試驗設計，該方法可以實現(xiàn)數(shù)量性狀或者質量性狀調控基因的精細定位，并且可以對某個性狀的多個主效位點同時進行定位。
（2）首先通過F2代遺傳圖譜進行初步定位，獲得某個性狀所有QTL信息，然后從BC1F1中篩選目標QTL雜合，其它背景QTL純合的單株，自交一代得到BC2F1，從大規(guī)模BC2F1再選擇極端性狀個體組成混池進行QTL-seq，去進一步縮小定位區(qū)間。
（3）作者以玉米株高為模式性狀展開QTG-seq研究，在chr7上關聯(lián)到候選基因Zm00001d020874。
?圖6 QTG定位研究思路圖
2、文章題目：Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy
發(fā)表期刊：Nature Communications
（1）普通QTL-seq選擇分離群體中極端性狀的子代個體構建2個混池，而GradedPool-Seq不僅選擇了極端個體，還把中間表型個體加入其中構成1-2個混池，最終構成“高值組”，“中值組”，“低值組”，再進行QTL的定位。相比之下，GradedPool-seq的定位精度通常要優(yōu)于僅使用兩個極端池進行的常規(guī)BSA。
（2）不再使用常見的SNP-index和ED算法進行性狀關聯(lián)，而是采用Ridit（relative to an identified distribution unit）算法會對每個位點的等位基因頻率進行計算，再對計算得到的p值進行滑窗法擬合，從而顯著降低背景噪音，實現(xiàn)精細定位。
總結
以上都是BSA方法必讀的經(jīng)典文章，從傳統(tǒng)的BSA分析篩選共分離markers，到BSA與高通量測序相結合的精準定位策略，極大地拓展了基因定位方法的范圍，能夠讓你從原理到方法全方面的了解BSA，如果后續(xù)開展這方面的研究，這些文章將會促進你快速入門。如果還有什么疑惑，歡迎點擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們可以為您免費進行文章研究思路設計。
當然，在了解BSA理論方法的同時，親自動手分析也是不可或缺的?？赡苡行┭芯空呔蜁Щ罅耍约簺]有生信基礎，不會敲代碼也不會跑流程，更沒有服務器等硬件設備，自己怎么分析BSA數(shù)據(jù)呢？交給服務公司是個不錯的選擇，不過項目成本就會增加，而且項目周期一般較長。那么，有沒有一種方式，可以讓研究者既不需要生信基礎，同時降低項目成本和縮短項目周期呢？
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