前沿|nanopore全長測序新方法nano-ID檢測新合成的isoform及其穩(wěn)定性

本文為大家分享一個基于nanopore平臺檢測新合成isoform及其穩(wěn)定性的技術。

真核基因通常產(chǎn)生多種RNA isoform，其可產(chǎn)生功能上不同的蛋白質變體。然而，RNA isoform的合成和穩(wěn)定性鮮少了解。原因是目前量化RNA代謝的方法是不能檢測RNA isoform的“短讀長”測序。

因此作者開發(fā)了nano-ID（nanopore sequencing-based Isoform Dynamics ），其結合了代謝RNA標記、天然RNA分子的“長讀長”納米孔測序和機器學習。

一個主要挑戰(zhàn)是尋找合適的核苷類似物用于RNA標記和檢測標記的RNA isoform，已知標記效率限制在約2-3％，即100個天然核苷酸中只有2個或3個被核苷酸類似物取代。作者利用ERCC標準品，分別以添加核苷酸類似物和不添加的天然堿基作體外轉錄，將體外轉錄產(chǎn)物進行nanopore direct RNA測序，比較了幾種不同的核苷酸類似物：5EU(5-Ethynyluridine，5-乙炔基尿苷)、5BrU(5-bromouridine，5-溴尿苷)、5IU(5-iodouridine，5-碘尿苷)、4sU(4-thiouridine，4-硫代尿苷)和?6sG(6-thioguanine，6-硫鳥嘌呤)。最終結果表明：5EU和5IU標記檢出率比較高，且5EU對細胞無毒性。且5EU標記的新合成RNA中約有一半U可以被識別為5EU，且從原始電信號中可以明顯區(qū)分5EU和天然U堿基。選用5EU進行體內實驗。

整體的nano-ID方法如下，作者在人慢性髓系白血病細胞系K562中進行了體內研究：5EU處理60min組、5EU處理24h組和未處理組。同時，作者進行了polyA長度分析。

熱休克反應（42°C 60min）處理，許多RNA isoform改變了合成速率、穩(wěn)定性和剪接模式。nano-ID分析結果表明，對于某一個基因座對應的組合RNA混合物（基因水平）的代謝變化與單一轉錄本代謝變化差異非常大。雖然組合的RNA穩(wěn)定性與poly（A）尾巴長度相關，但是單個RNA isoform可以顯著偏離。nano-ID能夠在不同細胞狀態(tài)和條件下研究單個RNA分子和isoform水平的RNA代謝。

 

如果您的科研項目有問題，歡迎點擊下方按鈕咨詢我們。